说起脱氧核糖核酸可能有很多朋友不知道,但是说到DNA大家就比较熟悉了。也就是说,脱氧核糖核酸就是DNA。大家都知道,DNA具有储存生命基因的重要作用。但是,你知道dna提取时苯酚起什么作用吗?dna提取有几种办法呢?现在,就和小编一起来看看吧。
dna提取时苯酚起什么作用吗?
1、很多人都知道蛋白和DNA组成了染色体。蛋白质不能溶于苯酚中,但是蛋白质可以溶于苯酚。所以可以采用一定办法用苯酚来提取DNA。
2、一般来说,苯酚在DNA提取中可以抑制DNase的降解作用,与此同时使蛋白质变性。用苯酚来提取DNA时,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶,蛋白与DNA 联结键已断。
DNA提取有几种办法?
1、酚抽的提法:一般是用蛋酶K和SDS来破碎细胞,然后消化蛋白。
2、玻璃棒缠绕法来提取DNA:将裂解物铺于乙醇上,接着用盐酸胍裂解细胞,然后用带钩玻璃棒在界面轻轻搅拌,使得DNA沉淀液绕于玻棒之上。
3、可以采用甲酰胺解聚法:破碎细胞之后,接着用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合,接着通过透析来获得DNA。
4、异丙醇沉淀法:和酚抽的提法基本相似,区别在于仅用二倍容积异丙醇来替代乙醇,目的是去除小分子RNA。
5、加热法:这样能够快速获得DNA。一般加热96℃-100℃,然后进行离心后取上清,就可以提取dna。
相信大家在看了本文的介绍之后,对于dna提取的知识有了更多的了解,也明白了dna提取时苯酚起的作用。在这里,小编还给大家科普一下,一般用dna来鉴定亲子关系,人的口腔细胞、血液和唾液等适用于用亲子鉴定,十分靠谱。希望本文能够带给大家一定的帮助。
提取DNA主要有SDS和CTAB法,其实提取效果的好坏主要看提取的对象是什么样的材料,在提取之前一定要好好分析材料的特性,然后在设计实验步骤。
一)CTAB法
CTAB是一种去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中(0.7 mol/L NaCl)是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度(0.3 mol/L NaCl)时,从溶液中沉淀,通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开,然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液,再加入乙醇使核酸沉淀,CTAB能溶解于乙醇。
(二)SDS法
利用高浓度的SDS,在较高温度(55—65℃)条件下裂解细胞,使染色体离析,蛋白质变性,释放出核酸,然后采用提高盐浓度及降低温度的做法使蛋白质及多糖杂质沉淀(最常用的是加入5M的KAc于冰上保温,在低温条件下KAc与蛋白质及多糖结合成不溶物),离心除去沉淀后,上清液中的DNA用酚/氯仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。
以下是在提取热带水果DNA时设计的两种不同方法步骤,对比起来CTAB法好,在禾本科植物效果差不多!
1、 CTAB法
1) 在所需量的CTAB抽提液中加入2-巯基乙醇,使终浓度达2%(v/v)。将此溶液预热至65℃。
对于每克新鲜的叶组织大约需要4ml的2-ME/CTAB抽提液。
2) 用液氮(-196℃)或干冰(-78℃)冷却粉碎器/匀浆器,将0.5 g植物组织粉碎成细粉,然后将组织转移到2.0 ml离心管。
3) 加入800 ?l预热的2-Me/CTAB,混合使之充分湿润,于65℃温育20 min,不时颠倒混匀。
4) 待冷至室温后,加入800 ?l氯仿/异戊醇(24:1),颠倒混匀至溶液呈乳浊状----但不要振荡。25℃,10000 rpm离心10 min。
5) 上清(~700 ?l)转移至另一干净的离心管中,加入5 ?l RNaseA贮液,37℃温育30 min。
6) 加入700 ?l氯仿/异戊醇,颠倒混匀,25℃,10000 rpm离心10 min。
7) 上清(~600 ?l)转移至另一干净的1.5 ml离心管中,加入600 ?l异丙醇,颠倒混匀,室温或-20℃放置20 min。
8) 25℃,12000 rpm,离心10 min,收集沉淀。
9) 去上清,加1 ml70%乙醇洗涤沉淀两次。(25℃,12000 rpm,离心10 min)
10)凉干DNA,溶于50 ?l ddH2O,4℃保存备用。
2、 SDS法
① 将0.3 g植物材料于液氮速冻,然后在研钵中将其磨碎,将粉末转至2 ml离心管中。
② 加入1.2 ml预热至65℃的提取缓冲液(其中加入3 μl β—巯基乙醇,增加DNA的稳定性),置65℃水浴中放置30分钟,不时颠倒混匀。。
③ 加入0.45 ml 5M的醋酸钾,混匀,冰浴20分钟,在10000 rpm离心20 min。需要的话,Miracloth纱布过滤除去沉淀,上清液转入另一离心管中。
④ 加入等体积氯仿:异戊醇(24:1),轻轻颠倒混匀,12000 rpm离心15 min。
⑤ 转移上清液到另一新离心管中,加5 μl RNaseA贮液,37℃温育30 min。
⑥ 加入等体积氯仿:异戊醇(24:1),轻轻颠倒混匀,12000 rpm离心15 min。
⑦ 转移上清液到另一新离心管中,加入0.7V异丙醇,轻轻颠倒混匀,-20℃放置30分钟沉淀核酸。
⑧ 25℃,12000 rpm,离心10 min,收集沉淀。
⑨ 弃上清,70%乙醇洗两次。
⑩ 凉干DNA,溶于50 ?l ddH2O,4℃保存备用。
《转的》
CTAB
(hexadecyltrimethylammonium
bromide,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L
NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
注:CTAB溶液在低于15℃
时会形成沉淀析出,因此,在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15℃。
一、CTAB提取缓冲液的经典配方:
Tris-HCl
(pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;
EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性;
NaCl
提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中;
CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离;
β-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除。
二、CTAB提取缓冲液的改进配方:
(1)
PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖;
(2)
蛋白质的去除:酚/氯仿抽提使用变性剂变性(SDS、异硫氰酸胍等)高盐洗涤蛋白酶处理核酸分离,纯化;
(3)多糖的去除:高盐法:用乙醇沉淀时,在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M
NaCl,高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积),氯苯可以与多糖的羟基作用,从而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA:在500
μL
DNA液中加入200μl
20%
PEG8000
(含1.2
M
NaCl),冰浴20min.核酸分离,纯化;
(4)
多酚的去除:在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂:β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂:如PVP(聚乙烯吡咯酮),PEG(聚乙二醇),它们与酚类有较强的亲和力,可防止酚类与DNA的结合;
(5)
盐离子的去除:70%的乙醇洗涤核酸吸附,沉淀和溶解使用合适的吸附材料吸附核酸,其它的杂质均被洗掉,达到纯化DNA的目的另一种方式加入1/10体积的NaAc(pH5.2,3M),用预冷的乙醇或异丙醇沉淀RNA吸附或沉淀后应用70%的乙醇洗涤,以除去盐离子等若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNasepH值为8.0,可防止DNA发生酸解。
三、基因组DNA提取常见问题
DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质。DNA在溶解前,有酒精残留,酒精抑制后续酶解反应,DNA中残留有金属离子,有RNA的存留。对策:重新纯化DNA,去除蛋白、多糖、多酚等杂质,重新沉淀DNA,让酒精充分挥发,增加70%乙醇洗涤的次数(2-3次),加入RNase降解RNA。
(1)DNA样品不纯,抑制后续酶解和PCR反应。DNA提取常见问题:材料不新鲜或反复冻融、未很好抑制内源核酸酶的活性、提取过程操作过于剧烈,DNA被机械打断,外源核酸酶污染反复冻融。尽量取新鲜材料,低温保存材料避免反复冻融,液氮研磨或匀浆组织后,应在解冻前加入裂解缓冲液。在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时,可增加裂解液中螯合剂的含量,细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。所有试剂用无菌水配制,耗材经高温灭菌。将DNA分装保存于缓冲液中,避免反复冻融。
(2)DNA降解,DNA提取常见问题。实验材料不佳或量少,破壁或裂解不充分,吸附或沉淀不完全,洗涤时DNA丢失。尽量选用新鲜(幼嫩)的材料,动植物要匀浆研磨充分;G+菌,酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁。高温裂解时,时间适当延长(对于动物细胞,细菌可增加PK的用量)。增加吸附的时间、或低温沉淀小心操作。
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