链终止法原理(弗雷德里克·桑格的研究成果)

链终止法原理

通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链，由于合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而来读取待测DNA分子的顺序。核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长，如此每管反应体系中便合成以共同引物为5端，以双脱氧碱基为3端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段，根据片段3端的双脱氧碱

弗雷德里克·桑格的研究成果

桑格在1955年将胰岛素的氨基酸序列完整地定序出来，同时证明蛋白质具有明确构造。他利用自己新发现的桑格试剂（Sanger's reagent），也就是2,4-二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene）将胰岛素降解成小片段，并与专门水解蛋白质的胰蛋白酶混合在一起。再将一部分混合物的样本置放于滤纸的一面，并利用一种色层分析方法来做进一步的实验，首先他将一种溶剂从单一方向通过滤纸，同时又让电流以相反向通过。
由于不同的蛋白质片段有不同的溶解度与电荷，因此在电泳后，这些片段最后会各自停留在不同的位置，产生特定的图案。桑格将此图案称为“指纹”（fingerprints）；不同的蛋白质拥有不同的图案，成为可供辨识且可重现的特征。之后桑格又将小片段从新组合成氨基酸长链，进而推导出完整的胰岛素结构。因此得出结论，认为胰岛素具有特定的氨基酸序列。这项研究使他单独获得了1958年的诺贝尔化学奖。
1975年时，桑格发展出一种称为链终止法（chain termination method）的技术来测定DNA序列，这种方法也称做“双去氧终止法”（Dideoxy termination method）或是“桑格法”。两年之后，他利用此技术成功定序出Φ-X174噬菌体（Phage Φ-X174）的基因组序列。这也是首次完整的基因组定序工作。他所发明的技术比起当时其他方法使用了较不具毒性的材料。主要是先进行PCR，利用DNA引子和DNA聚合酶使DNA链得以展开复制，再利用双去氧核苷酸（dideoxynucleotides）来终止DNA链的合成。实验会使不同序列的DNA带有不同长度，使其得以经由电泳来做分析。
这项研究后来成为人类基因组计划等研究得以展开的关键之一，并使桑格于1980年再度获得诺贝尔化学奖，与桑格合作研究的沃特·吉尔伯特，以及另一团队的保罗·伯格（Paul Berg）也一同获奖。第二座诺贝尔奖使他成为继玛莉·居里、莱纳斯·鲍林，以及约翰·巴丁之后的第四位两度获奖者。到了1979年，桑格又与吉尔伯特和伯格一同获得哥伦比亚大学的路易莎·格罗斯·霍维茨奖（Louisa Gross Horwitz Prize）。