流感中心：内地8例甲型流感病例检测到病毒变异

有关甲型h1n1流感的几个问题

甲型H1N1流感百问

一、甲型H1N1流感及其防治措施

1、本次流感流行最早是怎么发现的?

本次流感流行的首例确诊病例是墨西哥Veracruz州Lagloria的一名4岁小男孩,于2009年3月28日在美国加州实验室被确诊为一种新型的甲型H1N1流感病毒感染,并于3月30日在加州发现了第二例病例。4月12日,来自Oaxaco的一名妇女来到墨西哥城专业治疗呼吸道疾病的医院就诊,13日死亡,成为首例死于甲型H1N1流感病毒感染的患者。
4月16日,墨西哥政府发布流感疫情警报,向泛美卫生组织进行通报,PAHO依照程序向世界卫生组织(WorldHealthOrganization,WHO)通报。WHO在4月25日发出全球警告,墨西哥和美国发生的甲型H1N1流感疫情已构成“具有国际影响的公共卫生紧急事态”。
随后,这种新型病毒引起的流感疫情迅速蔓延到美国、加拿大等国家,截至5月3日,全球已有19个国家和地区报告发现确诊的甲型H1N1流感病例。

2、为什么WHO将本次流感病毒名称由原来的“猪流感”改称为“甲型H1N1流感”?

2009年4月24日,WHO证实墨西哥发生多名“猪流感”患者,4月27日,世界动物卫生组织发表公报,对“猪流感”的称谓率先提出异议。按照以往以发源地为流感命名的传统,将其称为“北美流感”更加合理,而且这次新的流感病毒此前未在猪等动物体内发现,目前仅在人际间传播,因此该命名不但不够准确,还会引起不必要的恐慌,给养殖业造成沉重的打击。随后,这些观点得到了越来越多专家的呼应。WHO负责卫生安全和环境事务的助理总干事福田敬二于4月29日对媒体表示,这种病毒只在人际间传播。
4月30日,WHO宣布,将使用“甲型H1N1流感”一词来代替此前提到的“猪流感”一词。虽然导致此次流感的病毒是猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒基因重组而来的新病毒,但到目前为止,这种病毒主要使人患病,“猪流感”容易使公众对猪肉制品产生误解,并已对一些国家的养殖业带来了影响,及时改名有助于缓解人们对养殖生猪、食用猪肉的不安情绪。
5月2日,加拿大已经发现了猪被感染的事实,检测到的病毒与北美人间流行的甲型H1N1流感病毒相同,怀疑是被患病后从墨西哥返回的猪厂工人感染。尽管如此,这一新的事实尚不足以挑战由原来的“猪流感”改称为“甲型H1N1流感”的理由。据目前掌握的情况表明,本次流感流行并不是完全与猪没有关系,猪已经作为配角卷入到这场流行中,猪间能否发生甲型H1N1流感流行尚需继续关注。

3、本次流感病毒是如何产生的?

本次流感的病毒是甲型H1N1流感新病毒,是猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒基因重组后产生的新毒株,而不是源自于猪流感病毒的变异。

4、这种病毒能引起流感大流行吗?

流感大流行是指当甲型流感病毒出现新亚型或较大变异(抗原转变)时,人群普遍缺乏相应免疫力,造成病毒在人群中快速传播,从而引起流感在全球范围的广泛流行。流感大流行具有发病率和病死率高、传播迅速和波及范围广的特点。 由于本次流感的毒株属于甲型流感病毒的新变异株,人群对其普遍易感,而且目前至少在WHO一个区域的两个国家已经发生了人传人,因此全球应引起高度重视。

5、WHO对流感大流行的警告级别是如何规定的?

WHO对流感大流行的警告共有6个级别。第1级:没有动物流行的流感病毒导致人感染的报告。第2级:有家养或野生动物中流行的流感病毒导致人感染的报告,具有发生大流行的潜在危险。第3级:动物间或人与动物间重组的流感病毒导致人出现散发病例或小规模聚集性病例,但并未造成持续的社区范围的人际间传播。第4级:动物间或人与动物间重组的流感病毒导致持续的人际间传播,造成社区暴发。第5级:同种病毒导致WHO一个区域的至少两个国家发生社区持续性暴发。第6级:在第5级基础上,同种病毒在WHO另一个区域的至少一个国家发生社区持续性暴发。

6、到目前为止,本次流感流行达到什么级别?

WHO4月29日晚在日内瓦宣布,将全球流感大流行警告级别从目前的第4级提高到第5级。第5级意味着同一类型流感病毒已在WHO同一地区至少两个国家发生人间持续性传播。

7、WHO宣布流感大流行警告级别为第5级时,我国应该采取什么应对措施?

警告级别第5级表示同一类型流感病毒已在WHO同一地区至少两个国家发生人间持续性传播,提示病毒有可能造成全球大流行。根据我国相关防控预案,应立即发布橙色警报,并启动流感大流行的应对措施,特别是加强边境检疫,必要时中断与某些疫区国家的航空往来等措施,如发现有密切接触者进入我国境内,政府应发布公告,对密切接触者进行追踪和医学观察。

8、为什么本次流感流行引起全世界的关注?

由于本次甲型H1N1流感病毒是一个新的变异株,人群普遍易感,而且已经至少在两个国家(墨西哥和美国)发生了持续的人传人,具有全球发生流感大流行的可能性。WHO2009年4月29日宣布当前流感大流行警戒从第4级提高到第5级。目前流感疫情进展迅速,从4月24日墨西哥报告出现流感流行以来,截至5月3日,全球已有19个国家和地区报告发现确诊的甲型H1N1流感病例。

9、本次流感的主要临床表现是什么?

根据目前美国初步调查结果提示,本次流感的临床表现与季节性流感基本相似,包括发热、咳嗽、咽痛、身体疼痛、头痛、发冷和疲劳等,有些还会出现腹泻或呕吐、肌肉痛或疲倦、眼睛发红等,重者会继发肺炎和呼吸衰竭。根据目前的观察,其临床表现的严重程度似乎不如历史上历次流感大流行严重。

10、甲型H1N1流感的传染源是什么?

传染源是患病的人或者隐性感染者,目前没有发现包括猪在内的各种动物可以作为传染源对人类构成威胁。

11、甲型H1N1流感的传播途径是什么?

甲型H1N1流感主要通过患者咳嗽或打喷嚏的方式在人群中传播;此外,人接触了附着于物体表面的病毒后再触摸自己的眼、口、鼻也可感染病毒。

12、甲型H1N1流感的易感人群有哪些?

人群普遍易感,而是否感染取决于接触机会和防护措施。目前报告的患者多数年龄在25岁至45岁之间,以青壮年为主,但这一现象是否具有普遍性尚有待观察。根据既往流感流行的 经验,应关注老人和儿童的感染。

13、甲型H1N1流感在什么时间具有传染性?

现有资料提示,甲型H1N1流感与季节性流感的传染期相似,病人在发病前1～2天至发病后7天都具有传染性。若病例发病7天后仍有发热症状,表示仍具有传染性。儿童,尤其是幼儿,传染期可能长于7天。

14、甲型H1N1流感的潜伏期有几天?

甲型H1N1流感与季节性流感的传染期相似,潜伏期一般1～7天。

15、甲型H1N1流感的病死率有多高?

根据目前已有的资料,墨西哥报告死亡病例176例,美国报告死亡病例1例,但由于没有准确的发病人数,无法准确计算病死率。墨西哥报告的死亡病例数较多,但传播到美国和加拿大等国后病死数极少,可能与病毒传代后的毒力变化、宿主、医疗救治等因素有关,具体原因不清。通常病死率是在流行结束时评价,因为目前流行尚未结束,对本次甲型H1N1流感的病死率尚无法最终定量判断。根据全球资料估计,与过去流感大流行相比,目前病死率明显低于历次流感大流行。科学家们正在密切关注动态变化。

16、甲型H1N1流感的预后如何?

从目前报告的流感病例来看,预后良好,多数病例可自愈。
许多病例没有进行医学治疗和使用抗病毒药物即已痊愈。除了墨西哥报告较多死亡病例外,美国、加拿大、西班牙等国家的感染者则显示病情较轻。
由于流行仍在继续,病毒是否会进一步发生演变而影响疾病的预后有待进一步观察。

17、甲型H1N1流感有特效药物预防吗?

甲型H1N1流感目前没有特效预防药物。如果周围出现疑似病例后,可在医生指导下服用合适的抗病毒药物,目前供选择的药物有达菲、乐感清、金刚烷胺、金刚乙胺及中草药等。
需要注意的是,不要单独依靠药物来预防流感,应该采取综合预防措施预防流感发生。另外,也不建议为了预防的目的,在健康人群中使用抗病毒药物,因为这会加速耐药性的发展。

18、去年秋冬季接种的季节性流感疫苗对本次甲型H1N1流感是否有预防作用?

去年接种的季节性流感疫苗对预防本次甲型H1N1流感的效果有待于观察,一般认为由于两种病毒都属于甲1型流感病毒,虽然有差别,但可能有一定的交叉保护作用。

19、个人如何预防甲型H1N1流感?

使用肥皂和清水勤洗手,尤其在咳嗽或打喷嚏后;咳嗽或打喷嚏时用纸巾遮住口、鼻,然后将纸巾丢进垃圾桶;避免接触有流感样症状(发热、咳嗽、流涕等)的人;避免前往人群拥挤场所;保证充足睡眠、勤于锻炼、减轻压力,保证摄入足够营养。

20、目前甲型H1N1流感最新的诊断方法是什么?

中国疾病预防控制中心已经研制出特异而且灵敏的快速诊断方法,4个小时即可出结果,该诊断方法可以区分普通甲型H1流感与本次甲型H1N1流感。从2009年5月1日起开始装备全国疾病预防控制中心的网络实验室系统。

21、如何对甲型H1N1流感病例进行治疗?

目前主要治疗方法包括综合对症支持疗法、抗病毒药物治疗和中医辨证治疗。如出现细菌感染,可使用抗生素。患者要注意休息、多饮水,注意营养;对高热、临床症状明显者,应拍胸片,查血气。

22、可使用哪些药物治疗甲型H1N1流感?

甲型H1N1流感病毒感染后,在医生指导下,可使用达菲和乐感清,但需在发病后48小时内开始使用,剂量75毫克/天,疗程5天;也可使用国产抗病毒药物金刚烷胺和金刚乙胺治疗;同时可以按照专家推荐的中医处方使用中草药治疗。

23、甲型H1N1流感病毒的抵抗力如何?

流感病毒为有囊膜病毒,故对乙醚、氯仿、丙酮等有机溶剂均敏感,200ml/L乙醚4℃过夜,病毒感染力被破坏;病毒对氧化剂、卤素化合物、重金属、乙醇和甲醛也均敏感,10g/L高锰酸钾、1ml/L升汞处理3分钟,750ml/L乙醇5分钟,1ml/L碘酊5分钟,1ml/L盐酸3分钟和1ml/L甲醛30分钟,均可灭活流感病毒。流感病毒对热敏感,56℃条件下,30分钟可灭活;对紫外线敏感。

24、什么叫医学观察?

在病例的传染期内(发病前1～2天至发病后7天)与病例有过接触,或1周内曾到过流行区者,需对其采取一定的控制措施(居家或者在医院隔离),每日进行观察,测量体温和健康询问,做好登记,观察期为该疾病的最长潜伏期7天。观察期间尽量减少外出活动。

25、为什么要进行医学观察?

通过医学观察,可使密切接触者和到过疫区的人一旦发病,能够及时被发现和诊断,得到及时治疗,又可避免和减少将病原体传播给其他人。这是一项对病例的密切接触者和周围人群的医学保护措施。

26、医学观察期间出现可疑症状,如何处理?

对医学观察期间出现发热、咳嗽或咽痛等呼吸道症状者,在采取有效防护的条件下,应立即送定点医疗机构进行诊断和隔离治疗。

27、什么叫甲型H1N1流感疑似病例?

曾到过流行区,或与甲型H1N1流感患者有密切接触史(也可流行病学史不详),1周内出现流感临床表现,呼吸道分泌物、咽拭子、痰液、血清H亚型病毒抗体阳性或核酸检测阳性者。

28、什么叫甲型H1N1流感临床诊断病例?

被诊断为疑似病例,且与其有共同暴露史的人被诊断为确诊病例者称为临床诊断病例。

29、什么叫甲型H1N1流感确诊病例?

从呼吸道标本或血清中分离到特定病毒;以RT-PCR对上述标本进行检测,有甲型H1N1病毒RNA存在,经过测序证实,或两次血清抗体滴度4倍升高,可成为确诊病例。

30、对疑似、临床和确诊甲型H1N1流感病例如何管理?

疑似、临床和确诊病例应送至定点医疗机构进行为期至少7天的隔离治疗,若7天结束后仍发热,应继续隔离直至体温正常。隔离治疗期间,疑似、临床和确诊病例要分开管理。

甲型H1N1流感病毒能治吗

卫生部通报，9月4日15时至9月7日15时，中国内地新增甲型H1N1流感确诊病例1177例，其中17例为境外输入性病例，1160例为境内感染病例。新疆、宁夏和青海9月5日首次报告确诊病例，西藏9月6日首次报告确诊病例，至此，中国内地31个省市自治区已全部报告确诊病例。 截至9月7日，中国内地累计报告5592例甲型H1N1流感确诊病例，已治愈3852例，没有因甲型H1N1流感所致的死亡病例。 甲型流感病毒已经蔓延全球，演变为普通的病毒性流感，覆盖了全世界范围；国内已经H1N1甲型流感疫苗研制成功。注射以后21天就能产生自身抗体，少数人会有副作用反应。 卫生部长陈竺说，甲型H1N1流感疫苗进入接种阶段，第一步将向易感人群接种疫苗，例如有基础性疾病的人群、特殊领域的工作者等。疫苗使用顺序将依据核心人群、高危人群、重点人群和适用人群的顺序为参考。核心人群是指处理疫情的相关人员；高危人群包括出入境接待人员、疫情防控物资生产人员以及发热门诊、传染门诊的医务人员；重点人群包括慢性病人以及体弱多病者；适用人群包括儿童、学生、老人。猪流感发病主要症状有：眼睛红、头痛和流涕和呼吸困难，激烈咳嗽，眼鼻流出黏液！不及时处理会随时出现死亡，死亡率7%！ 如果感染了H1N1甲型流感病毒及时去医院治疗，7~10天就能康复痊愈回家啦！痊愈后就有了自身免疫。[疫情]病毒侵入性变强部分患者不发烧 墨西哥部分甲型H1N1患者不出现发烧症状，世卫称：警告级别可能将升至最高级！！！！！！ 正在全球传播的甲型H1N1流感继续肆虐，在过去的24小时内，全球确诊病例激增1748例。 同时，美国等国科学家发现突变的流感病毒，墨西哥部分患者不出现发烧症状，为进一步防控增加难度。世界卫生组织驻华代表处新闻官原博雍上午告诉记者，流感传播警告级别有可能提升至最高级别6级。 最新疫情 一天激增千余确诊病例 截至北京时间16日4时，有关国家和地区发布的甲型H1N1流感最新简报显示，全球共有36个国家及地区正式报告8232例甲型甲型H1N1流感感染病例，比24小时前增加1748例。确认死亡病例达66例。 疫情严重程度仅次于墨西哥的美国16日报告更多病例和死亡病例，厄瓜多尔首次确诊感染病例，英国新增4例确诊病例，墨西哥疫情状况依然严峻。 纽约市市长迈克尔·布隆伯格14日宣布，由于纽约皇后区两座中学和一座小学暴发甲型H1N1流感疫情，这些学校将从15日开始关闭，下周整周停课。 这三所学校有在校生共计4500人。 病毒突变 变体病毒出现 可能更具侵入性 据墨西哥流行病学与疾病控制中心负责人表示，墨西哥检测到发生突变的甲型H1N1流感病毒。类似情况在美国和加拿大也被发现。这让学者非常担心，因为有可能新病毒具有更强侵入性。 俄罗斯媒体5月15日报道，当天墨西哥流行病学与疾病控制中心负责人米克表示，在进行荧光抗体试验时检测到了A病毒，但却无法将其归类。墨西哥卫生部长对上述情况评论说，其变异几率甚至超过艾滋病病毒。 据英国媒体报道，世卫组织表示，甲型H1N1流感病毒还可能继续变异成毒性更强的病毒，引发流感大暴发，足以在全球引起更大规模的疫情。 部分患者不出现发烧症状 美国传染病权威专家说，墨西哥的很多甲型H1N1流感患者，包括一些重症患者在就诊时都未出现发烧症状，这种情况会增加防控甲型H1N1流感的难度。

甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案的本方案旨

在为全国流感监测网络实验室提供甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案，不用作商业活动或赢利目的。
一、标本的采集种类和要求
1、推荐采集的呼吸道标本种类
疾病发病后应尽快采集如下标本：鼻拭子、咽拭子、鼻腔吸取物、鼻腔冲洗液。气管插管的病人也应收集气管吸取物。标本应置于无菌病毒采样液，并立即用冰块或冰排保存或置于4 ℃ （冰箱），并马上送至实验室。（临床样品采集人员及实验室检测人员的感染控制指导请见相关文件。） 采样同时填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本采样单。（附表1）
2、拭子的选择
标本应使用头部为合成纤维的拭子（例如，聚酯纤维），用铝或塑料做柄。不推荐棉拭子和木柄。标本采集管应包含3毫升病毒采样液（含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生长的抗生素，缓冲液）
3、临床标本储存要求
保存在4℃（不能超过4天）或者-70℃或-70℃以下。有条件的实验室均应保存在-70℃或-70℃以下。不应保存在-20℃。
4、标本的分装处理
标本送至实验室后，立即进行处理，避免反复冻融。将原始标本分为三份，一份用于核酸检测，一份用于病毒分离，一份保存待复核。
5、标本的运输
疑似人感染甲型H1N1感染病例列为 A类，用UN2814包装运输。填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本送检单（附表2）。
二、核酸检测
基于PCR原理的核酸检测方法是一种快速有效的诊断方法，在突发传染病应急工作中发挥了巨大作用。
1、基于real-time RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒（引物和探针序列为美国CDC设计）：
4月29日WHO网站上公布了美国CDC设计的针对此次甲型H1N1流感病毒的real-time RT-PCR引物和探针，此实验用于检测疑似甲型H1N1流感病例的呼吸道样本, 因此，用此real-time RT-PCR的方法，建议首先筛选甲型流感病毒并排除季节性流感病毒和H5N1禽流感病毒。real-time RT-PCR方法参见附件3（中文翻译版），附件4（英文原版）。
2、基于RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒（引物序列为国家流感中心设计）：
目前国家流感中心设计了RT-PCR方法检测新的甲型H1N1流感病毒。RT-PCR的方法参见附件5。
三、病毒分离鉴定
可采用鸡胚和/或MDCK细胞进行流感病毒分离。具备相应条件的网络实验室在收到标本后24h内进行病毒接种。具体方法参见附件6和7。
四、适用于实验室工作人员的甲型H1N1流感病毒生物安全
（一）实验室级别及个人防护
1、对采集自属于感染甲型H1N1流感病毒疑似病例的患者的临床标本进行的诊断性实验工作，在BSL-2实验室内进行。所有样本操作均应在生物安全柜（BSC）内进行。遵循生物安全三级个人防护。
2、对采集自属于感染甲型H1N1流感病毒疑似病例的患者的临床标本进行的病毒分离培养工作，应在BSL-3实验室内进行，并遵循生物安全三级个人防护。
（二）健康监测
1、所有人员均应自测发热及其他症状。
2、感染甲型H1N1流感病毒的症状包括咳嗽、喉咙痛、呕吐、腹泻、头痛、流鼻涕和肌肉疼痛。如有不适，应立即向上级报告。
3、如有人员在无防护情况下暴露于甲型H1N1流感确诊病例的临床标本或活病毒，应考虑在暴露后的7天时间里使用奥司他韦或扎那米韦进行抗病毒药物预防。
五、附表和附件
附表1 疑似人感染甲型H1N1感染病例标本采样单
附表2 疑似人感染甲型H1N1感染病例标本送检单
附件3： real-time RT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程(2009版)（中文）
附件4： real-time RT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程(2009版)（英文）
附件5： RT-PCR方法检测甲型流感病毒
附件6：甲型H1N1流感病毒鸡胚分离方法
附件7：甲型H1N1流感病毒MDCK细胞分离方法
附表1
疑似人感染甲型H1N1流感病毒病例标本采样单姓名性别年龄职业※现住址发病日期标本#
种类标本量
（g或ml）采集
日期备注※选项：参照传染病报告卡。
#选项：A鼻咽拭子、 B鼻咽吸取物、C鼻腔冲洗液、D鼻腔吸取物、E气管吸取物、F其他（如为其他，请在表格中注明）
采集人员： 采集单位（盖章）：
附表2
疑似人感染甲型H1N1流感病毒病例标本送检单姓名性别年龄职业※现住址发病日期标本#
种类标本量*
（g或ml）采集
日期备注※选项：参照传染病报告卡
#选项：A鼻咽拭子、 B鼻咽吸取物、C鼻腔冲洗液、D鼻腔吸取物、E气管吸取物、F其他（如为其他，请在表格中注明）
*标本量：如果同一份标本有多个包装请注明。
填表人员：送样时间： 单位（盖章）：
附件3
real-time RT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程
中文翻译版（请同时参考英文原版）
请注意：体系建立请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。本规程中的体系仅供参考。
美国CDC实时RTPCR(rRTPCR)检测猪流感操作规程(2009版)
本规程所有权归属疾病控制中心，紧急状态时授权各公共卫生实验室使用。本规程不用作商业活动或赢利目的。
一、概 述
（一）前提
本规程基于对rRT-PCR方法的基本掌握。
（二）实验原理
实时荧光定量RTPCR(rRTPCR)法检测猪流感的方案是用一组寡核苷酸引物和双重标记的TaqMan®探针，对呼吸道样本或体外培养的猪流感病毒进行定性检测鉴定。InfA引物和探针为检测出甲型流感病毒而设计，swInfA引物和探针可特异性地检测出所有的猪甲型流感病毒，swH1引物和探针可特异性检测猪流感病毒H1亚型。本实验用于检测甲型流感阳性的疑似猪甲型流感感染病例的呼吸道样本。
（三）使用条件
一步法定量RT-PCR 96孔板热循环系统。
（四）生物安全要求
样本处理应在相应的生物安全实验室完成。
（五）样本要求
1、呼吸道样本
支气管肺泡灌洗液，气管抽吸物，痰，鼻咽或口咽洗液或拭子。拭子样本所用的拭子顶端应为人造材质（如聚脂或涤纶）、柄为铝制或塑料。不推荐使用棉头木柄的拭子。藻酸钙拭子采样不可取。
2、排除标准
1）未在2－4°C (≤4 天)或-70°C及以下保存的样本
2）以上未列的其它不当样本
（六）核酸提取
RT-PCR扩增效能依赖于样本模板RNA的质与量。RNA提取操作需经过检验核酸的纯度合格之后，再用于样本实验。商业化的操作程序中包括QIAamp® 病毒RNA提取试剂盒，RNeasy®小试剂盒 (QIAGEN公司)，罗氏MagNA Pure Compact RNA分离试剂盒, MagNA Pure LC RNA分离试剂盒II, 和罗氏MagNA总核酸纯化试剂盒，在推荐的操作程序下，可提取高纯度的RNA。
（七）免责声明：提到的厂家名仅用作举例，并不表示疾控中心认可。
二、实验材料
（一）试剂
1、一步法荧光定量RT-PCR探针试剂盒；
2、分子级无菌蒸馏水 (无RNA酶和DNA酶)；
3、正反向引物 (40μM)；
4、双重标记探针(10μM)；
5、阳性对照。
（二）供给
1、实验室标记笔；
2、微量离心管格栅，96孔0.2ml PCR反应管；
3、20μl 和 200μl 可调节移液器及滤芯枪头；
4、0.2ml PCR 反应管盘；
5、光学反应盖板；
6、无菌,无核酸酶的1.5 ml微量离心管；
7、一次性无粉手套。
（三）仪器设备
1. 微量离心机；
2. 漩涡振荡器；
3. 实时荧光定量PCR检测系统，含96孔的热循环反应板。
三、操作程序
（一）准备工作
1. 避免样品污染
由于fluorogenic 5’核酸酶测定的敏感性，应特别注意假阳性产生。推荐以下预防污染的方法：
1）实验准备与核酸提取使用独立区域；
2）实验准备与核酸提取使用专用设备（如移液器，微量离心机）和耗材（如微量离心管，吸头）；
3）实验开始后穿清洁工作服，并使用新的一次性无粉手套；
4）不同样本操作之间，以及怀疑可能污染的情况下均更换手套；
5）试剂和反应管的盖子应尽量关闭。
2、仪器准备
工作台、移液管、离心机必须清洁，用去污剂净化，例如5%的漂白剂、“DNAzap”或者“RNase AWAY®”来减小核酸交叉污染的风险。
3、试剂准备
注意：在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保持低温。
1）引物和探针
（1）分装好的冰冻的引物和探针进行融化（已融的探针避光2-8℃可保存多达3个月，不要对探针反复冻融）；
（2）涡旋振荡引物和探针；
（3）瞬时离心引物和探针，之后置于冰架上。
2）Real time RT-PCR的试剂
（1）将Master Mix和酶置于冰架上；
（2）融化2×的Reaction Mix；
（3）颠倒混合2×的Reaction Mix；
（4）瞬时离心2×的Reaction Mix和酶，置于冰架上。
4、对RT-PCR的每一步过程均进行检测
1）每个样品的RNA提取物通过分别的引物和探针进行检测：InfA, swFluA, Swine H1 (swH1) 和RNaseP (RP)。RNaseP引物和探针是以人的RNaseP基因为靶基因的，因此对于人的核酸可以作为内部阳性对照。
2）对于每一个过程中包括的所有引物和探针，均设立无模板对照（NTC）和阳性模板对照（PTC）。
3）人类样本对照（HSC）提供了次级阴性对照，以便确认核酸提取过程和试剂的完整性。
5、建立反应
反应检测混合物充分混合后加入到96孔板中。然后在适当的实验反应和对照中，加入水和提取的核酸或者阳性模板对照（PTC）。
1）为每一个引物和探针标记一个1.5ml的微量离心管；
2）对每一个建立的反应确定反应数（N）。考虑到NTC、PTC、HSC反应和吸量误差，制备过量的反应混合物是必要的。具体如下：
（1）如果包括对照，样品的数量（n）为1到14，那么N=n+1；
（2）如果包括对照，样品的数量（n）大于15，那么N=n+2。
3）Master Mix:计算加到每个引物/探针反应混合物中的各个试剂的量。计算如下：
* 体系建立请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。
4）加入水之后，通过上下吹打混匀反应混合物，不要涡旋振荡。
5）离心5s使混合物聚集管底，然后将管子置于冰架上；
6）准备板状的反应管子或者96孔板，置于冰架上；
7）每一个master mix吸取20μl到每一孔中，每排按顺序进行，如下图：
实验建立举例：
实验样本举例：
注意：在任何样本被加入之前，应该首先加入阴性模板对照（NTC）（第1列），用来检验master mix中的污染。HSC应该在待测样本之后加入（第11列），用来检验在样本准备或者加入过程中的交叉污染。阳性模板对照（PTC）应该在所有样品和阴性模板对照（NTC）之后被加入。
8）在将培养板移到核酸处理区域之前，在试验设定区域，在反应板的第一列将NTC反应进行。如上所述。
9）吸取5μl的nuclease free water到NTC孔，将NTC孔盖上。
10）将反应板盖上，移到核酸处理区域。
11）将含有样品的管子涡旋振荡5s，瞬时离心5s；
12）将提取的核酸样本置于冰架上；
13）如上所述，样品应该按列加入，吸取5μl的第一种样本到所有标记这种样品的孔中（例如，样本“S1”如上表格所示）。不同样本之间需更换枪头操作。
14）加完样本的孔要盖住，这将会帮助防止样品的交叉污染，并且能够使操作人员记录其加样的具体进程；
15）为了避免交叉污染，必要时更换手套；
16）对剩下的样本，重复步骤13-15；
17）加入5μl的HSC样品加到HSC孔中（第11列）。将HSC孔盖盖。
18）最后，加5μl阳性模板对照RNA到所有PTC孔中，将PTC孔盖上。
19）如果使用8个管子的条状板子，每一条都要做标签标记，来指明每一个样品的位置（不要在反应管子的顶部标记！）。瞬时离心条状管子10－15s，然后置于冰架上。如果使用培养板，4℃，500g离心30s，置于冰架上。
6、RT-PCR扩增条件
反应体系为25ul，反应条件如下：
注：在55度这一步骤中要收集荧光信号（FAM）。
* 具体扩增条件请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。
7、解释说明/检验
1）探针/引物的阴性对照反应中得到的荧光增长曲线不应该超过阈值线。如果一个或者多个引物和探针的阴性反应出现了假阳性，则样品可能已经被污染。那么整个实验过程是无效的，严格的按照步骤规则重新实验。
2）在37个循环处或者37个循环之前，所有的临床样本的RP反应曲线都应该超过阈值线，这表明从人类RNase P基因扩增到足够量的RNA，也表明了样本质量合格。然而，可能有些样本会由于初始临床样本中的细胞数量较少而无法出现阳性结果。同时，从动物/禽类体内或者经细胞培养得到的样本，经常会RP反应没有结果或者结果很弱。如果在所有临床样本中检测RNase P都阴性，则说明：
（1）从临床材料中对核酸的不适当的提取导致RNA的损失或者来自临床标本的RT-PCR抑制剂的残留污染；
（2）没有足够的人类细胞以备检测；
（3）方法建立和实施不当；
（4）试剂和仪器原因。
3）在40个循环之内，HSC组中InfA，swFluA，swH1探针的荧光增长曲线不应该超过阈值线。如果任何其中任何一个流感特异性探针的增长曲线超过了阈值线，那么有以下解释：
（1）可能由于RNA提取试剂污染。在实验前确保RNA提取试剂无误。
（2）RNA提取过程或建立反应加样过程发生交叉污染。严格遵照操作程序的要求进行重复实验。
（3）在40个循环之前，PTC反应的InfA, swInfA, swH1和RP反应应出现阳性结果。如果没产生预期的阳性结果则视为无效，应严格遵照操作程序进行重复实验。确定PTC反应失败原因，订正并记录错误原因及更改方案。不再使用没产生预期结果的PTC试剂。
（4）当所有对照都满足要求后，如果InfA反应增长曲线与阀值线在40个循环内有交叉时，则样本被视为A型流感病毒阳性。如果A型流感病毒反应呈阳性，那么Univ SW 和/或 SW H1也可能呈阳性。如果样本InfA和特异亚型反应（swInfA和swH1）的反正增长曲线与阈值线在40个循环内有交叉，则视该样本为猪流感病毒A/H1阳性。如果样本只有InfA和一个亚型的反应阳性或只有InfA阳性，请联系CDC做进一步指导。
（5）在所有对照都满足要求的前提下，如果在40个循环内，待测样本的所有InfA反应阴性则视该样本为阴性。
8、限制规定
1）实验员在实际操作之前应进行操作程序和试验结果分析的培训，熟练掌握后方可进行试验。
2）当样本量不足可能会产生假阴性结果，造成的原因可能是不当的收集，运输或处理。
3）如果反应中存在过量的DNA / RNA模板时也可能出现假阴性。如果某样本的RP反应被抑制，则可以将提取的RNA进行2倍或更大倍数的稀释（例如1：10或1：100）来重复试验。
9、备注
引物和探针参见英文版P7。
附件4
real-time RT-PCR方法检测鉴定甲型H1N1流感操作规程
（英文版）
附件5
基于RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒
一、目的
对采集的可疑病例标本进行检测，筛选甲型H1N1流感病毒并排除季节性H1N1流感病毒。
二、引物NIC引物引物名称碱基组成目的片段大小备注FluAFluA-M-F30TTCTAACCGAGGTCGAAACG235bp甲型流感病毒M基因通用检测引物FluA-M-R264ACAAAGCGTCTACGCTGCAGH1HAH1 F1147AAGAGCACACATAATGCCAT527bpH1N1亚型检测通用引物H1 R1673CCATTRGARCACATCCAGHuH1HAH1HA F768ACTACTGGACTCTGCTGGAAC327bp人季节性流感病毒H1N1亚型检测引物H1HA R1094CAATGAAACCGGCAATGGCTCCSWH1HA-1SW-H1 F786AATAACATTAGAAGCAACTGG153bp此次甲型H1N1亚型流感病毒引物SW-H1 R920AGGCTGGTGTTTATRGCACCRnasePRnaseP FAGA TTT GGA CCT GCG AGC G约80bp与real-time PCR中RnaseP引物一致RnaseP RGAG CGG CTG TCT CCA CAA GT三、材料及仪器
1、 RNA 提取试剂盒QIAGen RNeasy Mini Kit （catalog #74104）
2、β－巯基乙醇（SIGMA β-Mercaptoethanol Lot 062K0115）
3、70%乙醇
4、RT-PCR Kit：QIAGEN One step RT-PCR Kit（catalog #210212）
5、RNasin Ribonuclease Inhibitor （Promega catalog #N2111）
6、检测引物
7、Axygen 1.5mL离心管，货号：MCT-150-C
8、Axygen 0.2mL PCR管，货号：PCR-02-C
9、Axygen 10μL，100μL，200μL，1000μL带滤芯枪头
10、10μL，100μL，200μL，1000μL加样器
11、可调转速14K离心机：
12、旋涡混合器：
13、生物安全柜：二级生物安全柜
14、PCR仪：
15、琼脂糖：Biowest Agarose Distributed by Gene Tech（Shanghai）Company Limited Lot No. 101685
16、核酸染料：
17、电泳液：5×TBE电泳缓冲液 cat No. 9009032718．电泳槽、电泳仪
四、实验步骤
（一）RNA提取
1、根据标本数量分装RLT液：从Kit中取出RLT液，用1.5mL离心管分装，每管500μL（在体系配制区操作）。
2、在生物安全柜内将采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）取100μL加入RLT液管中，充分混匀。
3、每管分别加入5μL β-巯基乙醇，混匀后依次加入600μL 70%的乙醇，充分混匀。
4、从Kit中取出带滤柱的2mL收集管，打开包装将其做好标记。取步骤（3）中的混合液600μL加入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃收集管中的离心液。
5、滤柱仍放回收集管上，将步骤（3）剩余的混合液全部吸入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃离心液。
6、于滤柱中加入700μL Wash Buffer RW1液，12000rpm，离心15s。
7、从QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支干净的2mL收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，12000rpm，离心15s。
8、弃收集管中的离心液，再于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，13000~14000rpm，离心2min。
9、将滤柱移到一个干净的1.5mL eppendorf管上，向滤柱中加入30~50μL的Rnase-free Water，室温静置1~3min。
10、12000rpm，离心1min，收集离心液即为提取的病毒RNA，立即做实验或-20℃以下保存。
注意：Buffer RPE使用之间加44mL无水乙醇。
（二）反应体系配制
1、实验设计：
检测标本RNA
质控参数：
阴性对照：无菌水（标本RNA提取时，跟标本同时提取无菌水。）
阳性对照：已知病毒RNA
2、PCR反应体系配制（在体系配制区配反应液）
1）按下表加入试剂：
PCR反应体系组 分体 积（μL）RNase Free Water
5×RT-PCR Buffer11.9×n
5×n10mM dNTP Mixture1×nEnzyme Mix1×nRNase Inhibitor0.1×n上游引物0.5×n下游引物0.5×nTotal20×n对每一个建立的反应确定反应数（n=拟进行的PCR管数，包括阴性，阳性对）。考虑到阴性无模板对照，阳性对照，误差，制备过量的反应混合物是必要的。具体如下：
（1）如果包括对照，样品的数量（n）为1到14，那么N=n+1；
（2）如果包括对照，样品的数量（n）大于15，那么N=n+2。
2）将上述反应液混匀，分装到0.2mL PCR小管中，每管20μL，分别做好标记。
3）加RNA模板（在核酸提取区）
将上述分装好的PCR小管分别加入模板。首先加入阴性对照管（5μL无菌水），然后分别加标本RNA（每管5μL），最后加入阳性对照RNA（每管5μL）。
3、RT-PCR反应
将上述加好模板的反应管混匀，短暂离心后放入PCR仪进行RT-PCR
扩增，反应程序如下：温度 (C)时间循环数60℃1min142℃10min50℃30min95℃15min94℃30s3552℃30s72℃1min72℃7min14℃保存4、RT-PCR产物检测
1）2.0%琼脂糖凝胶制备：称取2.0g Agarose，倒入耐热玻璃瓶内，再加入电泳液（1×TBE）100mL，轻轻混匀后加热，使Agarose完全熔化。待Agarose胶温度降至50～60℃左右，加入核酸染料，轻轻混匀（不要产生气泡）。待胶温度降至50℃左右时，将其倒入制胶板，插好电泳梳子。待胶完全凝固（约30～60min）之后，将梳子拔出。
2）将制备好的电泳胶放入电泳槽（带梳子孔的一端在阴极），倒入电泳液（1×TBE）浸过胶面即可。
3）PCR产物各取10μL，加入2μL上样缓冲液（6×Loading Buffer），混匀后加入电泳胶孔内（先加Marker（DL－2000）5μL，然后依次加标本PCR产物，再加阴性对照，最后加阳性对照产物）。
4）电泳电压100V，约30～40min后看结果。
5）将电泳胶放入凝胶成像系统观察结果并照相。
5、结果判断
在系统成立，即阴阳性参考均正常的条件下，各引物所代表意义如下：PCR引物待检样品1待检样品2待检样品3待检样品4待检样品5待检样品6FluA_+++++/-H1HA__++++/-HuH1HA__+__+/-SWH1HA-1___+_+/-RnaseP+++++_结果判断非甲型流感病毒甲型流感病毒
非H1N1亚型人季节性H1N1亚型流感病毒猪H1N1亚型流感病毒
送国家流感中心复核送国家流感中心检测标本不是人源标本/标本中细胞量少/实验或仪器问题

甲型H1N1流感的资料

★★★★★
1。首先，发烧应注意不能盲目的吃退烧药，确需使用退烧药时也应严格按体重，控制在安全剂量正确服用，退烧药吃多了对身体不利，应查清病灶所在，对症下药，从根本上根治病灶。
2。甲型H1N1流感的早期症状与普通人流感相似，包括发热、咳嗽、喉痛、身体疼痛、头痛、发冷和疲劳等，有些还会出现腹泻或呕吐、肌肉痛或疲倦、眼睛发红等症状或其中部分症状，如果不及时治疗，病情延续会继发肺炎和呼吸衰竭，甚至死亡。
3。注意：猪流感早期高烧体温并非全部都是马上高于39°，也有渐渐升高或反复发作的。
4。虽然秋季到来，季节交替的时候很多人都容易感冒，发烧等身体不适，但甲型H1N1流感的早期症状恰恰与普通人感冒相似，很难鉴别。由于现在是甲型H1N1猪流感流行时期，如果其症状与甲型H1N1流感症状中的部分早期症状相似，为了安全起见，就应该极早到医院发热门诊或感染性疾病科去检查一下，做一个甲型H1N1流感病毒检测。
5。注意：现在是甲型H1N1猪流感流行时期，去医院这种高传染源的地方一定要戴上口罩，口罩要选标准的防尘口罩，薄的普通口罩只能保证病不传染给别人，却无法保证去医院途中及就诊时被别人传染H1N1 。马虎不得！！！！！！
6。我建议如果有与甲型H1N1流感相似的症状出现，感觉身体不适，就应该马上到公立医院去检查一下.免得耽误病情！大医院有保障些，迟了会影响您的健康。
★★★★★ 祝您早日康复! ★★★★★

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