布朗运动是指分子在液体或气体中通过无规运动的方式进行的运动。这种无规运动对于生物学中的化学反应有着重要的影响。布朗定律告诉我们,分子无规运动的速度与温度成正比,而分子无规运动的距离与时间成正比。因此,我们可以通过控制温度来控制分子无规运动,从而影响化学反应的速率和效果。
布朗定律:分子无规运动如何影响生物学中的化学反应?
在生物学中,许多化学反应发生在细胞内。例如,酶催化的反应是生物体内最常见的化学反应之一。酶是一种蛋白质,能够促进化学反应的发生。酶的催化是通过与底物结合形成酶-底物复合物来实现的。这个复合物会在一定时间内发生化学反应,随后分离成产物和酶。分子无规运动对于这个过程的速率有着重要的影响。当温度升高时,分子无规运动的速度也会加快,分子之间的相互作用也会加强,从而加速酶催化的反应速率。
除了酶催化反应之外,分子无规运动还会影响溶解度和扩散速率。溶解度是指溶质在溶剂中的最大浓度。当温度升高时,溶质分子的分布范围也会增加,从而增加了分子之间的相互作用,导致溶解度下降。另外,分子无规运动对于扩散速率也有着重要的影响。扩散是指分子由高浓度区域向低浓度区域的运动。当温度升高时,分子无规运动的速度也会加快,从而加速了扩散速率。
在生物学中,分子无规运动还会影响蛋白质的折叠和功能。蛋白质的折叠是指多肽链在特定的条件下形成特定的三维结构。这个过程是非常复杂的,涉及到多种因素的相互作用。其中一个因素就是分子无规运动。当温度升高时,蛋白质的分子无规运动也会加快,从而影响蛋白质的折叠和功能。
总之,分子无规运动对于生物学中的化学反应有着重要的影响。通过控制温度,可以控制分子无规运动的速度和效果,从而影响化学反应的速率和效果。此外,分子无规运动还会影响溶解度、扩散速率和蛋白质的折叠和功能。
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宏观上好象是无规则的热运动,但实际上争对每一个分子的话,分子的运动完全遵循能量守衡定律、动量定律和动量守衡定律,分子间的碰撞是弹性碰撞。在两次碰撞之间是匀速直线运动的的。
下面有网友说布朗运动是分子运动是错误的,布郎运动是大颗粒的固体在各个方向所受的冲力不平衡所产生的,它只能表明分子在做无规则的运动,但它本身并不是分子的运动.
宇宙中所有分子的运动是无法算出来的,即使是一滴水中所有分子的运动,你采取大型计算机也难算出一秒种内的所有分子间的作用关系.
主要内容:
一、硅基质离心柱制备DNA和RNA的工作原理
1. 裂解
裂解方法可能会根据需要DNA或RNA而有所不同,但其共同点是含有高浓度离液盐的裂解缓冲液。
杂化使氢键不稳定,范德华力和疏水相互作用。蛋白质不稳定,包括核酸酶,核酸与水的结合被破坏,为核酸与硅机制结合创造条件。
离液盐包括盐酸胍、异硫氰酸胍、尿素和高氯酸锂。
除了离液盐,裂解缓冲液通常还含有洗涤剂,有助于蛋白质的溶解和裂解。
根据样品类型,也可以使用酶进行裂解。蛋白酶k就是其中之一,实际上蛋白酶k在裂解缓冲液中起着非常好的作用;蛋白酶k的作用就越好,蛋白质变性越完全。然而,溶菌酶在裂解缓冲液的变性条件下不起作用,因此,通常在加入变性盐之前进行溶菌酶处理。
对于质粒的制备,裂解方式与提取RNA或基因组DNA有很大不同,因为必须先从基因组DNA中分离出质粒。
如果加入离液盐,将立即释放胞内物质,并且无法从高分子量染色体中区分出小的环状质粒。
因此,在质粒制备中,直到裂解后,才加入离液盐,并用于结合硅基质。
2. 结合硅基质(Binding)
离液盐对裂解和硅基质的结合至关重要。
为了增强核酸与硅基质的结合,在结合阶段还加入了乙醇。通常是乙醇,但有时可能是异丙醇。
乙醇的浓度和体积对结合有很大影响,浓度或体积太多会带来大量降解的核酸和小片段,进而影响UV260的读数,使核酸浓度降低。浓度或体积太少,可能很难洗掉膜上的残留盐。
重要的一点是,乙醇会影响结合,并且添加的量对于任何试剂盒都是优化的。修改该步骤有助于获得核酸提取的效果,因此如果遇到问题并希望排除原因,则可以进一步评估该步骤。
另一种问题的诊断方法,保留离心后过柱滤液,并进行沉淀操作,看是否有核酸。如果在裂解过程中使用SDS的表面活性剂,试着用NaCl作为沉淀剂,以避免污染DNA或RNA。
3. 洗涤步骤
裂解液通过硅胶膜离心,现在DNA或RNA与柱结合,杂质,蛋白质和多糖则通过。
但是,膜仍然会被残留的蛋白质和盐弄脏。如果样本来自植物,膜上仍会残留多糖,可能还有一些色素,或者如果样本是血液,膜可能呈棕色或黄色。
清洗步骤有助于去除这些杂质。通常有两种清洗方式,但因样本类型而异。第一次洗涤通常会用少量的离液盐来去除蛋白质和有色污染物。然后用乙醇清洗以除去盐。如果样本本身没有太多蛋白质,如质粒准备或PCR产物纯化,那么只需要乙醇清洗即可。
4. 离心柱的干燥
乙醇洗涤后,大多数操作步骤都有离心来干燥离心柱。这是为了去除乙醇,是清洁洗脱的必要步骤。当10mM Tris缓冲液或水填充到膜上进行洗脱时,核酸会水合并从膜上释放。如果柱上还有乙醇,那么核酸就不能完全再水化。
跳过干燥步骤会导致乙醇污染和核酸产量降低。
这个问题的主要迹象是当试图把样品加载到琼脂糖凝胶上时,即使在存在染料的情况下,DNA不会下沉,而是漂浮在缓冲液中。乙醇污染的另一个迹象是,如果你把样品放在-20摄氏度,它不会结冰。
5. 洗脱
最后一步是从硅基质中释放出纯DNA或RNA。对于DNA的处理,通常使用pH值在8-9之间的10 mM Tris。DNA在稍微碱性的pH下更稳定,在缓冲液中溶解更快。即使是DNA颗粒也是如此。水往往趋向于低pH值,低至4-5,在短时间内洗脱时,高分子量DNA可能不完全水化。通过让缓冲液在离心前在膜中停留几分钟,可以最大限度地洗脱DNA。
另一方面,RNA在弱酸性pH值下稳定,因此水是首选洗脱液。RNA很容易溶于水。
6. 离心柱操作时容易出问题的事儿
核酸回收率低:因素有很多,通常是裂解问题,或者是过柱结合时条件出现了问题。
确保使用新鲜的优质乙醇(100%)稀释缓冲液或添加到过柱结合步骤。
质量差的乙醇或者长期储存的乙醇可能吸水,导致乙醇浓度发生变化,如果洗脱缓冲液的配置出现问题,DNA或RNA就会被清洗时流失。
低纯度:如果样品被蛋白质污染(低260/280),那么可能是因为样品太多,蛋白质没有完全去除或溶解。如果样品的260/230比率很低,则问题通常是来自结合缓冲液或洗涤缓冲液中的盐。确保使用最高质量的乙醇来制备洗涤缓冲液,如果问题仍然存在,则提取是增加洗涤次数。
与其他样品相比,一些样品含有更多的抑制剂。环境样品特别容易出现纯度问题,因为在提取过程中腐殖物质会被溶解。腐殖质类似于DNA,很难从硅胶柱中除去。对于这种类型的样品,在过柱步骤之前需要使用去除蛋白质和腐殖质的专门技术。
降解: 主要是RNA,降解是由于样品储存不当或者裂解效率过低造成的,不过前提是用不含RNase的水洗脱,对于DNA预处理来说,降解并不是一个大问题,因为对于PCR来说,DNA有降解,扩增依旧可以良好进行。但如果不希望DNA剪切过于严重,那么不要使用太强的裂解方法。? PCR纯化注意事项: PCR纯化是所有硅基质离心柱技术中最简单的,因为它只需要添加高浓度的结合盐(通常在每个PCR反应体系中添加3-5倍体积)并离心柱体。因此,当PCR纯化试剂盒操作失败时,可能会特别令人沮丧。所以纯化前,最好在凝胶上检测一下扩增结果。
PCR反应体系中太多物质可在UV260处有吸收峰: 核苷酸、洗涤剂、盐和引物。PCR纯化试剂盒操作失败多数是因为没有获得扩增产物。
如果确定反应体系中,有PCR产物且浓度不低,可以保留过柱后的液体,如果DNA没有发生结合,还可以进行挽救,重新进行纯化。
二、DNA连接酶工作原理
DNA连接酶(EC 6.5.1.1)以共价方式将DNA的磷酸骨架与平末端或配对的粘性末端连接起来,其作用是修复DNA分子中断裂的双链。
在分子生物学中,它通常用于将限制性内切酶产生的DNA片段插入载体。商业连接酶提供含有ATP和Mg2+的反应缓冲液,这两种物质对连接酶活性都是必不可少的。
由于反复的冻融可能会破坏ATP,所以最好将溶液进行分装。
链接反应本身有两个基本步骤。首先,DNA末端必须偶然碰撞,并保持在一起足够长的时间,以便连接酶连接它们。
低温反应更容易。所有的分子在更高的温度下移动得更快,如果它们在低温下轻轻地漂浮在溶液中,而不是像在更高的温度下那样呼啸而过,那么两个DNA末端碰撞并保持在一起会更容易。对于粘性末端,较低的温度稳定了互补核苷酸之间的氢键,有助于保持性对位置。
第二步是酶促反应:DNA连接酶通过两步催化3′-OH与5′-磷酸基团连接。首先,与酶活性部位的赖氨酸残基相连的AMP核苷酸被转移到5′-磷酸。然后磷酸腺苷键被3′-OH攻击,形成共价键并释放腺苷酸。为了让酶进行进一步的反应,酶活性部位的AMP必须由ATP补充。
DNA连接酶在25℃时具有最佳活性,因此连接反应在使DNA末端连接在一起的最佳温度(1℃)和酶反应(25℃)之间的权衡温度下进行。通常在16℃下1小时是可以的,但是由于将DNA末端连接在一起是反应中最不有效的部分,因此通过将温度降低到4℃来促进这一点可以提供更高的效率。 然而,酶在这个温度下工作非常缓慢,因此需要很长的(如过夜)反应时间。
三、比色分析的工作原理
1.对硝基苯基磷酸酯—分析机制
对硝基苯磷酸酯(pNPP)作为一种合成底物广泛应用于各种磷酸酶的催化活性测定。pNPP的磷酸基团被酶裂解生成对硝基苯酚,由于对硝基苯酚在水中电子激发的最大波长为318nm,因此对硝基苯酚也是无色的。然而,在碱性条件下,对硝基苯酚转化为对硝基苯酚阴离子,导致向400nm左右的深色偏移(根据溶液条件将化合物的吸收峰改变为较长波长)。这是电磁光谱的蓝色边缘,但是由于我们看到反射光的颜色(与吸收光相反),溶液看起来是黄色的。
要记住的事情:
铬酸盐转移是分析的关键因素。
举例来说,如果酶的活性要求在酸性范围内有一个最佳的pH值,那么酸性磷酸酶的情况正好如此。
在这种情况下,为了获得所需的黄色,必须在终点添加强碱(例如氢氧化钠或氢氧化钾)。
2.孔雀绿—分析机制
对硝基苯磷酸测定是很好的,但是如果你最喜欢的磷酸酶不能有效地代谢pNPP呢?另一种市面上可买到的磷酸酶测定法是孔雀绿测定法。这种简单的测定方法是基于孔雀绿、钼酸铵和游离正磷酸盐(又称无机磷酸盐,pi)在酸性条件下形成的络合物。
正磷酸盐被磷酸酶分解后从磷酸化底物中释放出来,在硫酸溶液中与钼酸铵形成络合物。孔雀绿磷钼酸盐络合物的形成,在620-650nm处测量,与游离正磷酸盐浓度直接相关。因此,有可能量化蛋白质磷酸酶底物的磷酸化和磷酸释放。
要记住的事情:
这种方法仅测量无机游离磷酸盐;在测量之前,必须首先水解和中和有机磷酸盐(脂质结合或蛋白质结合磷酸盐)。了解不同种类的有机磷酸盐及其各自不同的水解自由能有助于优化分析条件。高能有机磷酸酯(缩醛磷酸酯、酸酐等)具有不耐酸的磷酸基团,可在低pH下孵育释放到溶液中。另一方面,低能有机磷酸盐(磷酸酯)在酸性溶液中稳定,需要更苛刻的条件(如热分解)才能用这种方法检测。
在大量孔雀绿存在下,3:1离子缔合物[(MG+)3(PMo12O40 3-)]容易在酸性水溶液中形成和沉淀。为了稳定水溶液中的1:1离子缔合物,在溶液中加入聚乙烯醇。
在分析过程中要考虑的另一件事是任何可能干扰分析的氧化还原反应的可能性。钼是一种过渡金属,因此存在于多种氧化状态。在钼酸盐阴离子中,它具有+6的氧化状态。通过有机化合物,如抗坏血酸和还原糖(即葡萄糖)或无机化合物(如SnCl2)还原酸化的Mo(VI)溶液,生成颜色为蓝色的Mo(IV)物质。
四、实验室级用水是如何纯化的?
1.蒸馏:像山丘一样古老的技术(或者至少像隐藏在山丘里的静物一样)。水被加热到沸点,然后冷凝成液体。这样可以除去许多杂质,但沸点等于或小于水的杂质也会被带入蒸馏液中。
2.微滤:在这项技术中,利用压力迫使水通过孔径为1至0.1微米的过滤器,以去除颗粒物。直径小于0.2微米的过滤器可去除细菌,即所谓的冷杀菌。
3. 超滤,使用更小的孔径(小于0.003微米)。这些基本上都是分子筛,用来去除直径大于孔径的分子。它可以用来清除病毒、内毒素、核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶。
4.反渗透。反渗透过滤器的孔径小于0.001微米,这使得它们能够根据直径筛选离子。这是用来脱盐的水。
5.通过活性炭床过滤,有助于去除吸附在炭表面的氯离子和有机化合物等物质。
6.紫外线辐射。紫外线是一种很明显的去除水中微生物的方法。它还可以通过将某些有机化合物分解成危害较小的产物用来净化水。
7. 去离子/离子交换。将水通过含有阳离子和阴离子树脂混合物的树脂床来去除水中的离子。水中的正离子被阴离子树脂颗粒所吸引,而负离子被阳离子树脂所吸引。其结果是从树脂床的另一端流出去离子水。
销售纯水水或净水系统通常将使用这些技术的组合。水的纯度越高,使用的技术就越多。
五、为什么酶有最适温度
每个生物学家都熟悉酶反应速率与温度的关系,如图所示。
我们知道来自大肠杆菌或温血动物的酶在37℃左右有一个最佳温度,而来自热排气细菌的酶有更高的最佳温度。
为什么酶有一个最佳温度分布?化学家有一个经验法则,温度升高10℃会使反应速度加倍。这个规则是从Arrhenius方程推导出来的。
基本上,随着温度的升高,反应物的动能也随之增加。这种动能的增加意味着反应物更容易与足够的能量发生碰撞,从而使反应发生,因此温度越高,反应速率越高。
温度上升:反应速率曲线的第一部分,其中速率随着温度的升高而增加,遵循Arrhenius方程。如果这种酶即使在高温下也完全稳定,反应速度也会随着温度的升高而继续增加,直到发生其他事情,比如其中一种反应物变得受限。
平衡:反应速率开始趋于平稳,这是由于温度接近该酶变性温度(因此失去活性)。
温度下降:在更高的温度下,酶完全变性,失活。
变性发生的温度取决于酶的结构,而这又与酶的进化起源有关。大肠杆菌的酶已经进化到可以应对37℃左右的温度,而来自热喷口细菌的酶则被迫进化到可以在更高温度下保持稳定的程度。
因此,酶的最佳温度是基于Arrhenius模式对温度的依赖性(反应越热,反应速度越快)和酶接近变性温度时的不稳定性之间的权衡。
式中,B代表反应物或产物,vB为相应的化学计量系数,对反应物取负值,对产物取正值。根据相关计量标准,对于化学反应0=∑vBB,若任一物质B物质的量,初始状态时为nB0,某一程度时为nB,则反应进度ξ的定义为:
B
ξ=(nB-nB0)/vB=ΔnB/vB
由此可以概括出如下几点:
对于指定的化学计量方程式,vB为定值,ξ随B物质的量的变化而变化,所以可用ξ度量反应进行的深度。
由于vB的量纲为1,ΔnB的单位为mol,所以ξ的单位也为mol。
对于反应eE+fF——→gG+rR,可以写出:
ξ=ΔnE/vE=ΔnF/vF=ΔnG/vG=ΔnR/vR
对于指定的化学计量方程式,当ΔnB的数值等于vB时,则ξ=1mol。
焓变
焓是物体的一个热力学能状态函数,焓变即物体焓的变化量。
在介绍焓之前我们需要了解一下分子热运动、热力学能和热力学第一定律:
1827年,英国植物学家布朗把非常细小的花粉放在水面上并用显微镜观察,发现花粉在水面上不停地运动,且运动轨迹极不规则。起初人们以为是外界影响,如振动或液体对流等,后经实验证明这种运动的的原因不在外界,而在液体内部。原来花粉在水面运动是受到各个方向水分子的撞击引起的。于是这种运动叫做布朗运动,布朗运动表明液体分子在不停地做无规则运动。从实验中可以观察到,布朗运动随着温度的升高而愈加剧烈。这表示分子的无规则运动跟温度有关系,温度越高,分子的无规则运动就越激烈。正因为分子的无规则运动与温度有关系,所以通常把分子的这种运动叫做分子的热运动。
在热学中,分子、原子、离子做热运动时遵从相同的规律,所以统称为分子。
既然组成物体的分子不停地做无规则运动,那么,像一切运动着的物体一样,做热运动的分子也具有动能。个别分子的运动现象(速度大小和方向)是偶然的,但从大量分子整体来看,在一定条件下,他们遵循着一定的统计规律,与热运动有关的宏观量——温度,就是大量分子热运动的统计平均值。分子动能与温度有关,温度越高,分子的平均动能就越大,反之越小。所以从分子动理论的角度看,温度是物体分子热运动的平均动能的标志(即微观含义,宏观:表示物体的冷热程度)。
分子间存在相互作用力,即化学上所说的分子间作用力(范德华力)。分子间作用力是分子引力与分子斥力的合力,存在一距离r0使引力等于斥力,在这个位置上分子间作用力为零。分子引力与分子斥力都随分子间距减小而增大,但是斥力的变化幅度相对较大,所以分子间距大于r0时表现为引力,小于r0时表现为斥力。因为分子间存在相互作用力,所以分子间具有由它们相对位置决定的势能,叫做分子势能。分子势能与弹簧弹性势能的变化相似。物体的体积发生变化时,分子间距也发生变化,所以分子势能同物体的体积有关系。
物体中所有分子做热运动的动能和分子势能的总和叫做物体的热力学能,也叫做内能。热力学能与动能、势能一样,是物体的一个状态量。
初中我们学过,改变物体内能的方式有两个:做功和热传递。
一个物体,如果它跟外界不发生热交换,也就是它既没有吸收热量也没有放出热量,则外界对其做功等于其热力学能的增量:
ΔU1=W
如果物体对外界做功,则W为负值,热力学能增加量ΔU1也为负值,表示热力学能减少。
如果外界既没有对物体做功,物体也没有对外界做功,那么物体吸收的热量等于其热力学能的增量:
ΔU2=Q
如果物体放热,则Q为负值,热力学能增加量ΔU2也为负值,表示热力学能减少。
一般情况下,如果物体跟外界同时发生做功和热传递的过程,那么物体热力学能的增量等于外界对物体做功加上物体从外界吸收的热量,即:
ΔU=ΔU1+ΔU2=Q+W
因为热力学能U是状态量,所以:
ΔU=ΔU末态-ΔU初态=Q+W
上式即热力学第一定律的表达式。
化学反应都是在一定条件下进行的,其中以恒容与恒压最为普遍和重要。
在密闭容器内的化学反应就是恒容过程。因为系统体积不变,而且只做体积功(即通过改变物体体积来对物体做功,使物体内能改变,如在针管中放置火柴头,堵住针头并压缩活塞,火柴头会燃烧),所以W=0,代入热一定律表达式得:
ΔU=Q
它表明恒容过程的热等于系统热力学能的变化,也就是说,只要确定了过程恒容和只做体积功的特点,Q就只决定于系统的初末状态。
在敞口容器中进行的化学反应就是恒压过程。所谓横压是制系统的压强p等于环境压强p外,并保持恒定不变,即p=p外=常数。由于过程恒压和只做体积功,所以:
W=W体积=-p外(V2-V1)=-(p2V2-p1V1)
其中W为外界对系统做的功,所以系统对外做功为负。压强乘以体积的改变量是系统对外做的功,可以按照p=F/S,V=Sh,∴Fh=pV来理解。
将其代入热一定律表达式得:
Q=ΔU-W=U2-U1+(p2V2-p1V1)=(U2+p2V2)-(U1+p1V1)
因为U+pV是状态函数(即状态量)的组合(即一个状态只有一个热力学能U,外界压强p和体积V),所以将它定义为一个新的状态函数——焓,并用符号H表示,所以上式可变为:
Q=H2-H1=ΔH
它表明恒压过程中的热等于系统焓的变化,也就是说,只要确定了过程恒压和只做体积功的特点,Q就只决定于系统的初末状态。
焓的物理意义可以理解为恒压和只做体积功的特殊条件下,Q=ΔH,即反应的热量变化。因为只有在此条件下,焓才表现出它的特性。例如恒压下对物质加热,则物质吸热后温度升高,ΔH>0,所以物质在高温时的焓大于它在低温时的焓。又如对于恒压下的放热化学反应,ΔH<0,所以生成物的焓小于反应物的焓。
在化学反应中,因为H是状态函数,所以只有当产物和反应物的状态确定后,ΔH才有定值。为把物质的热性质数据汇集起来,以便人们查用,所以很有必要对物质的状态有一个统一的规定,只有这样才不致引起混乱。基于这种需要,科学家们提出了热力学标准状态的概念。热力学标准状态也称热化学标准状态,具体规定为:
气体——在pθ(101kPa,上标θ指标准状态)压力下处于理想气体(我们周围的气体可以近似看作理想气体)状态的气态纯物质。
液体和固体——在pθ压力下的液态和固态纯物质。
对于一个任意的化学反应:
eE+fF——→gG+rR
其中e、f、g、r为化学计量系数。若各物质的温度相同,且均处于热化学标准状态,则g mol G和r mol R的焓与e mol E和f mol F的焓之差,即为该反应在该温度下的标准摩尔反应焓或标准摩尔反应热,符号为ΔrH(T),其中下标“r”指反应,“T”指反应时的热力学温度,“m”指ξ=1mol,ΔrH的单位为kJ·mol-1。
ξ读作“可赛”,为反应进度,对于反应eE+fF——→gG+rR,可以写成:
0=gG+rR-eE-fF=∑vBB
B
式中,B代表反应物或产物,vB为相应的化学计量系数,对反应物取负值,对产物取正值。根据相关计量标准,对于化学反应0=∑vBB,若任一物质B物质的量,初始状态时为nB0,某一程度时为nB,则反应进度ξ的定义为:
B
ξ=(nB-nB0)/vB=ΔnB/vB
由此可以概括出如下几点:
对于指定的化学计量方程式,vB为定值,ξ随B物质的量的变化而变化,所以可用ξ度量反应进行的深度。
由于vB的量纲为1,ΔnB的单位为mol,所以ξ的单位也为mol。
对于反应eE+fF——→gG+rR,可以写出:
ξ=ΔnE/vE=ΔnF/vF=ΔnG/vG=ΔnR/vR
对于指定的化学计量方程式,当ΔnB的数值等于vB时,则ξ=1mol。
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