流感检测采集(流感新城疫抗原胶体金试纸的使用方法)

流感检测采集

　　现在病原微生物的检测方法丰富多彩。我们常规检测的病原，可以针对病原本身去检测，如使用显微镜，直接检测病原（如细菌、真菌等）。

　　检测样本采集有哪些注意事项？

　　流感病毒和一些非典型病原体（比如肺炎衣原体或者鹦鹉热衣原体等），以及病毒不能独立存活繁殖，多存在于粘膜上皮细胞内。因此我们要注意，流感病毒感染，采样的时候就不能轻描淡写的在相应部位轻轻的沾一下，建议稍微用力采集到呼吸道上皮细胞。脱落的上皮细胞可见于所有呼吸道分泌物。强调使用分子生物学方法检测，最主要的一点就是分子生物学检测的灵敏度高，即使原始样本中病原量少也可以检测出来。另外，应注意，有些病原在健康人群是很少存在定植的情况，一般认为健康人群少见甲流、乙流病毒定植，所以在就诊人群中一旦检测出来，同时患者有相关症状的话，即可确诊。其他的呼吸道病毒，比如鼻病毒或呼吸道合胞病毒，在健康人群是有少量定植的，特别是儿童，这时要根据半定量结果，再结合患者本身的症状和免疫状况综合判断。

　　流感病毒实验室检测，样本类型可包括鼻腔分泌物、鼻腔冲洗液、鼻咽拭子、咽拭子、咽冲洗液。

　　一般而言，咽部采集样本病毒量略低。分子生物学比较灵敏，因此应用的样本种类比较广泛。而抗原检测的灵敏度不高，所以有时如果不是在病毒量高峰时采样或者不是采集的鼻咽部拭子，而只是咽拭子，尤其是医生、护士或者其他相关医疗人员没有严格按照操作在咽部转动3~5周，略微用力的话，都可能导致阳性率下降，患者可能是感染患者，但是没有检测出来。

　　下呼吸道样本，包括痰液、气管吸出物、Balf，都可以检出病毒。如果怀疑肺炎，从口咽部到下呼吸道采样也可以反映出来。一旦检出，强烈指向患者存在相关部位感染。

　　因为甲流、乙流以及呼吸道合胞病毒与腺病毒、巨细胞病毒、EB病毒不同，为RNA病毒，容易被环境中RNA酶降解，建议保存于特定样本保存液中送检，其中含有抑制RNA酶的成分，能够减少RNA降解，提高检出的阳性率。

　　最好采集哪种样本类型？

　　样本类型最好去采集鼻咽拭子或鼻拭子，患者会略有不适，因此应选择比较柔软的拭子，多数试剂厂家在提供试剂时会提供相应采样拭子。不能采用木棍的棉拭子直接伸进鼻子或咽部采集样本，患者会比较痛苦，舒适度差，且不易到达有效部位，阳性率相对下降。

　　样本采集如何操作？

　　通常后鼻咽部的拭子所能沾取的病毒量高于前鼻或咽部拭子；将柔和、头部尖的拭子由鼻腔插入，沿鼻腔壁伸入鼻咽部，直至感觉到一定阻力，转动3-5次，然后将该拭子取出，进行抗原检测或者相应的分子生物学检测，如果不能及时进行分子生物学检测，要放在RNA保存管中。如果是咽拭子，直接在咽部采集即可。特别是在儿科就诊的患者，或者患者的特殊情况，采鼻咽拭子存在一定难度，如果使用分子生物学检测的手段，或者预判患者的病毒载量比较高的情况下，即使用抗原检测，也可以采咽拭子。注意采咽拭子时不要在口腔内随意比划一下，可能仅沾到一点儿唾液，需在后咽部稍微有力度的转3-5次，是比较理想的采样方式。

流感新城疫抗原胶体金试纸的使用方法

  提要：本文主要介绍禽流感新城疫抗原胶体金试纸的使用方法，并就具体操用、判定认知和试纸本身检测等生产实际中常用的一些问题进行了探讨。
  关键词：禽流感新城疫胶体金试纸  操作野毒  疫苗毒  检测
禽用禽流感新城疫抗原胶体金快速诊断试纸相比于传统的诊断方法具有很多优点，一经推出便受到了较好的应用。其准确及时的诊断能为疾病的防疫和控制争取了到宝贵的时间，许多养殖场、种禽场也因此避免了因无法及时确诊疾病所带来的不应有的损失。试纸条的主要优点如下：

1、快速。十几分钟就能快速捕捉相关病毒，确定疾病。而酶联反应法（ELISA法）和基因扩增法（PCR法）则需要几个小时以上。

2、灵敏。好的产品灵敏度最低值是3×103EID50/ml，而感染禽流感或新城疫的家禽排毒量常在108EID50/ml以上。所以完全可以满足广大基层生产和诊断实际需要。

补：通俗地说，一般试纸的灵敏度高于0.25个血凝单位。其中使用的单克隆抗体对不同的毒株会有不同的结合度，比如对于KR1的流感毒株的灵敏度就是0.031个血凝单位，而对于分型的毒株的单克隆抗体，其灵敏度就是0.062个血凝单位。不分型的单抗是针对核衣壳蛋白的，而分型用的单抗则是对于血凝素上的某个位点的。对于野毒来说，大部分的灵敏度仍高于0.25个血凝单位，分型的试纸高于0.5个血凝单位。

有许多朋友问这个东西准不准，实际上它与早孕试纸使用差不多，没有几个人怀疑早孕试纸的准确性。这个试纸主要的问题在于研发时的难度比早孕试纸大，使用起来差不多。

3、及时。由于是捕捉病毒，所以不但在疾病前驱期和症状明显期能够测到，在潜伏期排毒时就能检测。能将诊断疾病的时间大大提前。而抗体测定则要晚几天到十几天，才能测到抗体的变化。这对快速发病的高致病力禽流感和强毒株新城疫病来说就太晚了。而且由于禽流感毒株的变异，常使新的毒株能够避开疫苗产生的抗体的攻击（免疫逃逸）而使家禽养殖场在疫苗抗体很高很好时遭受巨大的损失，而这一变化在抗体测定上常反映不出来。

4、简便。携带方便操作简单，田间野外也可进行操作，且不需要专门的仪器。不象ELISA和PCR方法需要价格不菲的仪器、专门的实验室和专业的培训。

5、价廉。成本低廉，从几元到几十元不等。一栋5000只的鸡舍一般使用一两条即可。

6、稳定。试纸2～30℃常温保存一般在一年半以上。好的产品保存期长达两年以上。

7、面广。鸡、鸭、鹅、鸽、火鸡、孔雀、鹌鹑等大部分家禽都能测定。可采集的样本有气管液体、肠道内容物、泄殖腔内容物和经处理的脏器组织等。

但是试纸作为新出现的高科技产品在使用过程中，仍有一些需要注意的问题。下面从具体操作、判定及判定认知和试纸本身检测三个方面就遇到一些问题进行探讨，以期达到抛砖引玉的作用。

一、    试纸具体操作上的一些问题

（一）、正常操作步骤

目前一套完整的试纸常分两种：一种是一条试纸、一个含病毒洗脱液瓶的洗液瓶、一个吸液管、一个棉签；另一种其它一样，只是在功能上将洗液瓶和吸液管合并成一个可以做滴液瓶的组合洗液瓶，其瓶盖上有一个可折的下部中空的小杆，打开后反转洗液瓶即可做滴管。正常的操作步骤如下：

1、用棉签在合适的地方（气管、肠道、泄殖腔等处）取样。

2、将样本插到装有洗脱液瓶中并加以搅拌。盖好瓶盖并加以摇晃，使病毒尽量从样本中释放到洗脱液中。

3、用吸管吸取上部较清液体，滴到试纸的滴孔处。陆续滴4～5滴。如果是可作滴管的组合洗液瓶，则掰开瓶盖上的小杆，露出小孔反转小瓶作滴管用。

4、30分钟内观测结果。

（二）具体使用中的一些技巧

1、采样要求

鉴于家禽排毒量与日龄常呈正相关，日龄越小排毒量相对越少。所以建议六十天以下的小鸡剖检取样，六十天以上鸡可以通过泄殖腔采样。从已死亡的家禽身上取样时要注意，气管采样不取痰，只在气管清亮处或病变部位采就行。在十二指肠、小肠中段卵黄蒂周围取样时，要用剪子轻刮一下打开的肠道面，在暴露出的肠道淋巴滤泡肿胀、出血和溃疡的部位取样就行。

因为试纸本身是捕捉病毒的，所以只取眼观发病或病死家禽就行，不用象测抗体那样，按比例随机抓家禽。试纸初始设计是一条试纸测一只家禽，实际应用中可以一条试纸测3～5只家禽的样本，这样既扩大采样量增加了准确率，又能大幅降低使用成本。就是要注意多次使用的棉签，注意每次采样后要尽量将含棉球部分沿洗脱液瓶转着挤一下，让样本液尽量多留到洗脱液中，又能使棉球再具一定的吸水力以便再采样有效。同时要注意多次采样时，所采样本不要过于粘稠，这样不利于金标在试纸上的流动。如果在滴液过程中发现因此原因而致金标流动不畅，可以在试纸滴孔上加一滴未用过的洗脱液助其流动，同时也可用棉签的另一端在滴孔处轻轻搅几下助样本液渗透。

2、加液要求

一般洗脱液要求加滴4～5滴，不要少加或多加。加少了，金标有时会跑不到试纸的未端；加多了，金标会飘浮，也不利于金标的流动。同时要注意试纸条放置要尽量水平。

3、金标流动

要让金标跑完后再下结论，因为试纸检测上喷涂有捕捉病毒用的单克隆抗体，其本身在硝酸纤维膜上有个高度，会对流动的金标有个阻挡作用，所以不要在金标流动中下结论。既使红色的金标液没有跑完，如有相应的病毒，检测线上会呈现一条直线。不是金标本身流动中头部产生的弯月形的曲线。

现在最新一代的金标试纸采用紫金技术，不再有现行红金技术的红雾和红弯曲线的干扰了。请广大使用者注意技术上的进步情况。

4、病毒量与检测线颜色的关系

检测线上的显示的病毒颜色与病毒的量成正比。色越深病毒越多，色越浅病毒越少。在生产实际中，随着发病家禽经防疫控制后再整体检测病毒，如果抗体上升较好，检测线上的颜色会从最初的较深逐渐变浅，直至消失，即病毒没有了或低于检测最低值了。这时家禽整体状态也会出现很好的恢复。

5、洗脱液与洗液瓶的问题

洗脱液之间配方稍有不同，可以混用，但最好专用。有些兽医想用生理盐水来代替洗脱液，这种想法不行。因为生理盐水洗脱病毒功能较差且没有洗脱液专有的缓冲系统作用和消泡等作用。

采样要求用专配的洗瓶瓶和吸管进行。尽量不要用其它代用品，因为已多次发现有的试验室的器具被病毒污染，尽管多次洗涤和消毒但仍能测到病毒（包括死病毒）的存在，应用这样器具就会出现不应有的假阳性。

6、试纸保存

试纸要求在2～30℃保存，禁止冷冻。

二、试纸结果判定与判定认知

胶体金试纸尽管操作简单，但也有个从不熟悉到熟练的过程。而试纸使用中更主要的问题表现在实验室结果与传统眼观和剖检经验之间的冲突。这类冲突在认知上的解决和整合对兽医诊疗水平的提高具有极大的意义。对于兽医适应养殖业升级的内在要求也有很大价值。

（一）、初期使用

刚开始使用试纸建议用标准抗原或活疫苗来熟悉和观察金标如何捕捉病毒并显色，同时与无病毒对照多次使用直到熟练为至。这种锻炼一是检测试纸灵敏度并建立对产品的信心，二是对后面的田间操作是个很好的基础。

有一部分使用者拿到试纸后直接用于田间测定，结果与通过眼观和剖检预判很一致。很快就能进行熟练掌握试纸的使用和相关的判定工作。但另外许多基层兽医使用者却没有这样幸运，主要问题有以下几种情况：

1、自己认为是新城疫或禽流感，或者眼观与剖检预判“确诊”是这些病时，用试纸检测却什么也测不到；而当自己认为只是轻微呼吸道不会是什么大病时，用试纸却能测到大量的新城疫病毒或禽流感病毒。

2、再一种情况是，与自己的经验严重不符。自己认为是新城疫，结果测出来是禽流感；或者自己认为是禽流感，却只能测到新城疫病毒。

如果连续出现几次这种情况，使用者就会出现两种认识倾向：一是产品根本不准，二是自己平时的诊断是否有问题，甚至怀疑“平时看的此类病例是不是半数都不对？”从本质上说，胶体金试纸实际上属于实验室用产品，出现上述情况是实验室结果与眼观和剖检的经验之间的冲突。如何解决这些冲突呢？

（二）、引起认识混乱的原因与解决方法

造成前述混乱情况有以下几种原因：

1、试纸操作不熟练。这可以通过多练习、多对比、多总结来解决。一般兽医人员经过几次练习就能熟练掌握操作要领。

2、所采样本不合适，没有抓到发病家禽或排毒家禽。这可以通过多抓几只家禽和多测几次来减少失误率。毕竟给家禽看病，是通过几个个体的检测来给群体定病的。

3、至于“自己”通过眼观和剖检所“确诊”的疾病，而试纸检测结果与“确诊”内容不符的情况。首先，确诊疾病是用实验室手段如病毒捕捉、基因测定、病毒分离等手段来验证，而不是反过来，眼观或剖检叫“确诊”。这也是一些“好兽医”心理深处不愿接受的。但这一关过不了。高新产品反而会成为这些兽医断病的一个障碍。

造成此种情况的另一个原因就是，眼见病症明显或家禽处于疾病转归期时，排毒量反而很少或不排毒了，尽管是禽流感或新城疫引起的，但却可能检测不到病毒。一般患症家禽是在疾病的潜伏期、前驱期和证状明显期三个阶段排毒较多，过了这些阶段的家禽排毒反而少了。另外一个情况就是目前家禽都大量做新城疫和禽流感疫苗，其产生的抗体对病毒的繁殖也会有程度不同的抑制作用。但这些可能通过多采患病家禽样本多用几条试纸检测来解决。

还有一个深层次的原因，就是养殖户认为“拿药出钱检测免费”，而兽医门市也不愿多贴钱。双方都不愿为确诊疾病而投入，这就导致实际操作中也不多病例采样本也不搞多次检测，使得检测没有深入进行。这种“重治不重防”的情况在种禽场也大量存在。这也说明我们疾病控制从“重治”转化“重防”不光是资金问题，还有深层次上心理认识和观念认识上的问题。

（三）、解决相关判定认知的意义

我国家禽养殖场已经越过生产与消费正反馈相互促进增长的阶段，进入相对饱和的状态。当前家禽业特别是肉鸡和蛋鸡养殖业已进入“祖代种鸡多、父母代种鸡多、商品代鸡多、消费量反而减少”的“三多一少”阶段，家禽养殖业就要摆脱“小规模大群体”进入“小群体大规模”的升级状态，其对兽医的要求也要大大提高。光凭眼观看病或“一把剪子闯天下”的时代就要结束了，所以积极引进胶体金试纸等新技术提高诊疗水平也是兽医和养殖场技术工作者的一个内在需求了。这也是下一步更激烈竞争的一个重要要求。

（四）、一些数据和问题

从使用试纸检测统计上的数据来看，在近几年检测到的近5000例新城疫与禽流感病例中，70%是新城疫、25%是禽流感H9、5%是禽流感H5。其中极少一部分是禽流感与新城疫混合感染。当然在某一阶段某一种疾病可能占主要数量。

由于家禽大量应用疫苗，就是发现新城疫和禽流感野毒也不一定严重发病，而且在一些抗体正常的种禽场或养殖场仍能检测到新城疫野毒和禽流感野毒的存在。变异病毒一旦出现免疫逃逸常会使养殖业造成极大的损失。

一些养殖场常在感染禽流感时习惯性地做新城疫疫苗，往往造成较大损失。也有一些门诊兽医将禽流感当新城疫“治”，让养殖户打Ⅰ系苗，结果造成大量死亡，引起较大的“医患纠纷”。

在实际检测中发现，禽流感无论是H9还是H5，与新城疫混合感染时，（在防止针头传播的前提下）做新城疫苗者均有较大损失。建议做二者的灭活苗。

还有一个发现就是，能在有的种鸡场种鸡发病时所用种蛋的孵化死胚中测到H5病毒和新城疫病毒，说明最少在种禽发生新城疫和禽流感时应停用种蛋，新城疫与禽流感能否垂直传播还要待科研人员研究。

（五）、关于野毒与疫苗毒的问题

试纸本身并不能分出野毒和疫苗毒。但我国目前只有注射用的禽流感油乳剂灭活苗，且这些灭活的病毒不会出现在试纸样本采集的气管和肠道部位。所以只要试纸检测到病毒，它就是野毒。

我国的实验室曾研发成功禽流感新城疫基因重组苗。这个病毒是在新城疫病毒上表达一个H5血疑素蛋白，所以在试纸测量中，能测到新城疫病毒，通用型禽流感试纸测不到禽流感病毒，但禽流感H5试纸会检测到H5病毒（实际上是捕获了新城疫病毒上的禽流感H5的血疑素）。不过这一疫苗未在市场上流通。

新城疫油苗也不会被试纸检测到。但在活疫苗免疫后一周内，有可能测到疫苗毒。如果家禽群免疫应答正常时，一周后于测到疫苗毒的概率就大大降低了。但有一点还可以来帮助鉴别疫苗毒和野毒。一般情况下，疫苗毒不会引起家禽群出现大批发病情况。也就是疫苗毒不会出现眼观症状和剖检病变。从做苗时间、试纸测量和眼观剖检情况综合考虑也不难做出正确的判断。

            三、试纸本身的检测

试纸的灵敏度可以用标准抗原来测定，其中新城疫试纸还可以用活疫苗来检测。当然，试纸也能测量疫苗有没有病毒、病毒的大致含量。试纸不能直接检测油乳剂灭活苗，经处理去油后的灭活尿囊液是可以测定的。

甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案的本方案旨

在为全国流感监测网络实验室提供甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案，不用作商业活动或赢利目的。
一、标本的采集种类和要求
1、推荐采集的呼吸道标本种类
疾病发病后应尽快采集如下标本：鼻拭子、咽拭子、鼻腔吸取物、鼻腔冲洗液。气管插管的病人也应收集气管吸取物。标本应置于无菌病毒采样液，并立即用冰块或冰排保存或置于4 ℃ （冰箱），并马上送至实验室。（临床样品采集人员及实验室检测人员的感染控制指导请见相关文件。） 采样同时填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本采样单。（附表1）
2、拭子的选择
标本应使用头部为合成纤维的拭子（例如，聚酯纤维），用铝或塑料做柄。不推荐棉拭子和木柄。标本采集管应包含3毫升病毒采样液（含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生长的抗生素，缓冲液）
3、临床标本储存要求
保存在4℃（不能超过4天）或者-70℃或-70℃以下。有条件的实验室均应保存在-70℃或-70℃以下。不应保存在-20℃。
4、标本的分装处理
标本送至实验室后，立即进行处理，避免反复冻融。将原始标本分为三份，一份用于核酸检测，一份用于病毒分离，一份保存待复核。
5、标本的运输
疑似人感染甲型H1N1感染病例列为 A类，用UN2814包装运输。填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本送检单（附表2）。
二、核酸检测
基于PCR原理的核酸检测方法是一种快速有效的诊断方法，在突发传染病应急工作中发挥了巨大作用。
1、基于real-time RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒（引物和探针序列为美国CDC设计）：
4月29日WHO网站上公布了美国CDC设计的针对此次甲型H1N1流感病毒的real-time RT-PCR引物和探针，此实验用于检测疑似甲型H1N1流感病例的呼吸道样本, 因此，用此real-time RT-PCR的方法，建议首先筛选甲型流感病毒并排除季节性流感病毒和H5N1禽流感病毒。real-time RT-PCR方法参见附件3（中文翻译版），附件4（英文原版）。
2、基于RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒（引物序列为国家流感中心设计）：
目前国家流感中心设计了RT-PCR方法检测新的甲型H1N1流感病毒。RT-PCR的方法参见附件5。
三、病毒分离鉴定
可采用鸡胚和/或MDCK细胞进行流感病毒分离。具备相应条件的网络实验室在收到标本后24h内进行病毒接种。具体方法参见附件6和7。
四、适用于实验室工作人员的甲型H1N1流感病毒生物安全
（一）实验室级别及个人防护
1、对采集自属于感染甲型H1N1流感病毒疑似病例的患者的临床标本进行的诊断性实验工作，在BSL-2实验室内进行。所有样本操作均应在生物安全柜（BSC）内进行。遵循生物安全三级个人防护。
2、对采集自属于感染甲型H1N1流感病毒疑似病例的患者的临床标本进行的病毒分离培养工作，应在BSL-3实验室内进行，并遵循生物安全三级个人防护。
（二）健康监测
1、所有人员均应自测发热及其他症状。
2、感染甲型H1N1流感病毒的症状包括咳嗽、喉咙痛、呕吐、腹泻、头痛、流鼻涕和肌肉疼痛。如有不适，应立即向上级报告。
3、如有人员在无防护情况下暴露于甲型H1N1流感确诊病例的临床标本或活病毒，应考虑在暴露后的7天时间里使用奥司他韦或扎那米韦进行抗病毒药物预防。
五、附表和附件
附表1 疑似人感染甲型H1N1感染病例标本采样单
附表2 疑似人感染甲型H1N1感染病例标本送检单
附件3： real-time RT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程(2009版)（中文）
附件4： real-time RT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程(2009版)（英文）
附件5： RT-PCR方法检测甲型流感病毒
附件6：甲型H1N1流感病毒鸡胚分离方法
附件7：甲型H1N1流感病毒MDCK细胞分离方法
附表1
疑似人感染甲型H1N1流感病毒病例标本采样单姓名性别年龄职业※现住址发病日期标本#
种类标本量
（g或ml）采集
日期备注※选项：参照传染病报告卡。
#选项：A鼻咽拭子、 B鼻咽吸取物、C鼻腔冲洗液、D鼻腔吸取物、E气管吸取物、F其他（如为其他，请在表格中注明）
采集人员： 采集单位（盖章）：
附表2
疑似人感染甲型H1N1流感病毒病例标本送检单姓名性别年龄职业※现住址发病日期标本#
种类标本量*
（g或ml）采集
日期备注※选项：参照传染病报告卡
#选项：A鼻咽拭子、 B鼻咽吸取物、C鼻腔冲洗液、D鼻腔吸取物、E气管吸取物、F其他（如为其他，请在表格中注明）
*标本量：如果同一份标本有多个包装请注明。
填表人员：送样时间： 单位（盖章）：
附件3
real-time RT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程
中文翻译版（请同时参考英文原版）
请注意：体系建立请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。本规程中的体系仅供参考。
美国CDC实时RTPCR(rRTPCR)检测猪流感操作规程(2009版)
本规程所有权归属疾病控制中心，紧急状态时授权各公共卫生实验室使用。本规程不用作商业活动或赢利目的。
一、概 述
（一）前提
本规程基于对rRT-PCR方法的基本掌握。
（二）实验原理
实时荧光定量RTPCR(rRTPCR)法检测猪流感的方案是用一组寡核苷酸引物和双重标记的TaqMan®探针，对呼吸道样本或体外培养的猪流感病毒进行定性检测鉴定。InfA引物和探针为检测出甲型流感病毒而设计，swInfA引物和探针可特异性地检测出所有的猪甲型流感病毒，swH1引物和探针可特异性检测猪流感病毒H1亚型。本实验用于检测甲型流感阳性的疑似猪甲型流感感染病例的呼吸道样本。
（三）使用条件
一步法定量RT-PCR 96孔板热循环系统。
（四）生物安全要求
样本处理应在相应的生物安全实验室完成。
（五）样本要求
1、呼吸道样本
支气管肺泡灌洗液，气管抽吸物，痰，鼻咽或口咽洗液或拭子。拭子样本所用的拭子顶端应为人造材质（如聚脂或涤纶）、柄为铝制或塑料。不推荐使用棉头木柄的拭子。藻酸钙拭子采样不可取。
2、排除标准
1）未在2－4°C (≤4 天)或-70°C及以下保存的样本
2）以上未列的其它不当样本
（六）核酸提取
RT-PCR扩增效能依赖于样本模板RNA的质与量。RNA提取操作需经过检验核酸的纯度合格之后，再用于样本实验。商业化的操作程序中包括QIAamp® 病毒RNA提取试剂盒，RNeasy®小试剂盒 (QIAGEN公司)，罗氏MagNA Pure Compact RNA分离试剂盒, MagNA Pure LC RNA分离试剂盒II, 和罗氏MagNA总核酸纯化试剂盒，在推荐的操作程序下，可提取高纯度的RNA。
（七）免责声明：提到的厂家名仅用作举例，并不表示疾控中心认可。
二、实验材料
（一）试剂
1、一步法荧光定量RT-PCR探针试剂盒；
2、分子级无菌蒸馏水 (无RNA酶和DNA酶)；
3、正反向引物 (40μM)；
4、双重标记探针(10μM)；
5、阳性对照。
（二）供给
1、实验室标记笔；
2、微量离心管格栅，96孔0.2ml PCR反应管；
3、20μl 和 200μl 可调节移液器及滤芯枪头；
4、0.2ml PCR 反应管盘；
5、光学反应盖板；
6、无菌,无核酸酶的1.5 ml微量离心管；
7、一次性无粉手套。
（三）仪器设备
1. 微量离心机；
2. 漩涡振荡器；
3. 实时荧光定量PCR检测系统，含96孔的热循环反应板。
三、操作程序
（一）准备工作
1. 避免样品污染
由于fluorogenic 5’核酸酶测定的敏感性，应特别注意假阳性产生。推荐以下预防污染的方法：
1）实验准备与核酸提取使用独立区域；
2）实验准备与核酸提取使用专用设备（如移液器，微量离心机）和耗材（如微量离心管，吸头）；
3）实验开始后穿清洁工作服，并使用新的一次性无粉手套；
4）不同样本操作之间，以及怀疑可能污染的情况下均更换手套；
5）试剂和反应管的盖子应尽量关闭。
2、仪器准备
工作台、移液管、离心机必须清洁，用去污剂净化，例如5%的漂白剂、“DNAzap”或者“RNase AWAY®”来减小核酸交叉污染的风险。
3、试剂准备
注意：在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保持低温。
1）引物和探针
（1）分装好的冰冻的引物和探针进行融化（已融的探针避光2-8℃可保存多达3个月，不要对探针反复冻融）；
（2）涡旋振荡引物和探针；
（3）瞬时离心引物和探针，之后置于冰架上。
2）Real time RT-PCR的试剂
（1）将Master Mix和酶置于冰架上；
（2）融化2×的Reaction Mix；
（3）颠倒混合2×的Reaction Mix；
（4）瞬时离心2×的Reaction Mix和酶，置于冰架上。
4、对RT-PCR的每一步过程均进行检测
1）每个样品的RNA提取物通过分别的引物和探针进行检测：InfA, swFluA, Swine H1 (swH1) 和RNaseP (RP)。RNaseP引物和探针是以人的RNaseP基因为靶基因的，因此对于人的核酸可以作为内部阳性对照。
2）对于每一个过程中包括的所有引物和探针，均设立无模板对照（NTC）和阳性模板对照（PTC）。
3）人类样本对照（HSC）提供了次级阴性对照，以便确认核酸提取过程和试剂的完整性。
5、建立反应
反应检测混合物充分混合后加入到96孔板中。然后在适当的实验反应和对照中，加入水和提取的核酸或者阳性模板对照（PTC）。
1）为每一个引物和探针标记一个1.5ml的微量离心管；
2）对每一个建立的反应确定反应数（N）。考虑到NTC、PTC、HSC反应和吸量误差，制备过量的反应混合物是必要的。具体如下：
（1）如果包括对照，样品的数量（n）为1到14，那么N=n+1；
（2）如果包括对照，样品的数量（n）大于15，那么N=n+2。
3）Master Mix:计算加到每个引物/探针反应混合物中的各个试剂的量。计算如下：
* 体系建立请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。
4）加入水之后，通过上下吹打混匀反应混合物，不要涡旋振荡。
5）离心5s使混合物聚集管底，然后将管子置于冰架上；
6）准备板状的反应管子或者96孔板，置于冰架上；
7）每一个master mix吸取20μl到每一孔中，每排按顺序进行，如下图：
实验建立举例：
实验样本举例：
注意：在任何样本被加入之前，应该首先加入阴性模板对照（NTC）（第1列），用来检验master mix中的污染。HSC应该在待测样本之后加入（第11列），用来检验在样本准备或者加入过程中的交叉污染。阳性模板对照（PTC）应该在所有样品和阴性模板对照（NTC）之后被加入。
8）在将培养板移到核酸处理区域之前，在试验设定区域，在反应板的第一列将NTC反应进行。如上所述。
9）吸取5μl的nuclease free water到NTC孔，将NTC孔盖上。
10）将反应板盖上，移到核酸处理区域。
11）将含有样品的管子涡旋振荡5s，瞬时离心5s；
12）将提取的核酸样本置于冰架上；
13）如上所述，样品应该按列加入，吸取5μl的第一种样本到所有标记这种样品的孔中（例如，样本“S1”如上表格所示）。不同样本之间需更换枪头操作。
14）加完样本的孔要盖住，这将会帮助防止样品的交叉污染，并且能够使操作人员记录其加样的具体进程；
15）为了避免交叉污染，必要时更换手套；
16）对剩下的样本，重复步骤13-15；
17）加入5μl的HSC样品加到HSC孔中（第11列）。将HSC孔盖盖。
18）最后，加5μl阳性模板对照RNA到所有PTC孔中，将PTC孔盖上。
19）如果使用8个管子的条状板子，每一条都要做标签标记，来指明每一个样品的位置（不要在反应管子的顶部标记！）。瞬时离心条状管子10－15s，然后置于冰架上。如果使用培养板，4℃，500g离心30s，置于冰架上。
6、RT-PCR扩增条件
反应体系为25ul，反应条件如下：
注：在55度这一步骤中要收集荧光信号（FAM）。
* 具体扩增条件请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。
7、解释说明/检验
1）探针/引物的阴性对照反应中得到的荧光增长曲线不应该超过阈值线。如果一个或者多个引物和探针的阴性反应出现了假阳性，则样品可能已经被污染。那么整个实验过程是无效的，严格的按照步骤规则重新实验。
2）在37个循环处或者37个循环之前，所有的临床样本的RP反应曲线都应该超过阈值线，这表明从人类RNase P基因扩增到足够量的RNA，也表明了样本质量合格。然而，可能有些样本会由于初始临床样本中的细胞数量较少而无法出现阳性结果。同时，从动物/禽类体内或者经细胞培养得到的样本，经常会RP反应没有结果或者结果很弱。如果在所有临床样本中检测RNase P都阴性，则说明：
（1）从临床材料中对核酸的不适当的提取导致RNA的损失或者来自临床标本的RT-PCR抑制剂的残留污染；
（2）没有足够的人类细胞以备检测；
（3）方法建立和实施不当；
（4）试剂和仪器原因。
3）在40个循环之内，HSC组中InfA，swFluA，swH1探针的荧光增长曲线不应该超过阈值线。如果任何其中任何一个流感特异性探针的增长曲线超过了阈值线，那么有以下解释：
（1）可能由于RNA提取试剂污染。在实验前确保RNA提取试剂无误。
（2）RNA提取过程或建立反应加样过程发生交叉污染。严格遵照操作程序的要求进行重复实验。
（3）在40个循环之前，PTC反应的InfA, swInfA, swH1和RP反应应出现阳性结果。如果没产生预期的阳性结果则视为无效，应严格遵照操作程序进行重复实验。确定PTC反应失败原因，订正并记录错误原因及更改方案。不再使用没产生预期结果的PTC试剂。
（4）当所有对照都满足要求后，如果InfA反应增长曲线与阀值线在40个循环内有交叉时，则样本被视为A型流感病毒阳性。如果A型流感病毒反应呈阳性，那么Univ SW 和/或 SW H1也可能呈阳性。如果样本InfA和特异亚型反应（swInfA和swH1）的反正增长曲线与阈值线在40个循环内有交叉，则视该样本为猪流感病毒A/H1阳性。如果样本只有InfA和一个亚型的反应阳性或只有InfA阳性，请联系CDC做进一步指导。
（5）在所有对照都满足要求的前提下，如果在40个循环内，待测样本的所有InfA反应阴性则视该样本为阴性。
8、限制规定
1）实验员在实际操作之前应进行操作程序和试验结果分析的培训，熟练掌握后方可进行试验。
2）当样本量不足可能会产生假阴性结果，造成的原因可能是不当的收集，运输或处理。
3）如果反应中存在过量的DNA / RNA模板时也可能出现假阴性。如果某样本的RP反应被抑制，则可以将提取的RNA进行2倍或更大倍数的稀释（例如1：10或1：100）来重复试验。
9、备注
引物和探针参见英文版P7。
附件4
real-time RT-PCR方法检测鉴定甲型H1N1流感操作规程
（英文版）
附件5
基于RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒
一、目的
对采集的可疑病例标本进行检测，筛选甲型H1N1流感病毒并排除季节性H1N1流感病毒。
二、引物NIC引物引物名称碱基组成目的片段大小备注FluAFluA-M-F30TTCTAACCGAGGTCGAAACG235bp甲型流感病毒M基因通用检测引物FluA-M-R264ACAAAGCGTCTACGCTGCAGH1HAH1 F1147AAGAGCACACATAATGCCAT527bpH1N1亚型检测通用引物H1 R1673CCATTRGARCACATCCAGHuH1HAH1HA F768ACTACTGGACTCTGCTGGAAC327bp人季节性流感病毒H1N1亚型检测引物H1HA R1094CAATGAAACCGGCAATGGCTCCSWH1HA-1SW-H1 F786AATAACATTAGAAGCAACTGG153bp此次甲型H1N1亚型流感病毒引物SW-H1 R920AGGCTGGTGTTTATRGCACCRnasePRnaseP FAGA TTT GGA CCT GCG AGC G约80bp与real-time PCR中RnaseP引物一致RnaseP RGAG CGG CTG TCT CCA CAA GT三、材料及仪器
1、 RNA 提取试剂盒QIAGen RNeasy Mini Kit （catalog #74104）
2、β－巯基乙醇（SIGMA β-Mercaptoethanol Lot 062K0115）
3、70%乙醇
4、RT-PCR Kit：QIAGEN One step RT-PCR Kit（catalog #210212）
5、RNasin Ribonuclease Inhibitor （Promega catalog #N2111）
6、检测引物
7、Axygen 1.5mL离心管，货号：MCT-150-C
8、Axygen 0.2mL PCR管，货号：PCR-02-C
9、Axygen 10μL，100μL，200μL，1000μL带滤芯枪头
10、10μL，100μL，200μL，1000μL加样器
11、可调转速14K离心机：
12、旋涡混合器：
13、生物安全柜：二级生物安全柜
14、PCR仪：
15、琼脂糖：Biowest Agarose Distributed by Gene Tech（Shanghai）Company Limited Lot No. 101685
16、核酸染料：
17、电泳液：5×TBE电泳缓冲液 cat No. 9009032718．电泳槽、电泳仪
四、实验步骤
（一）RNA提取
1、根据标本数量分装RLT液：从Kit中取出RLT液，用1.5mL离心管分装，每管500μL（在体系配制区操作）。
2、在生物安全柜内将采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）取100μL加入RLT液管中，充分混匀。
3、每管分别加入5μL β-巯基乙醇，混匀后依次加入600μL 70%的乙醇，充分混匀。
4、从Kit中取出带滤柱的2mL收集管，打开包装将其做好标记。取步骤（3）中的混合液600μL加入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃收集管中的离心液。
5、滤柱仍放回收集管上，将步骤（3）剩余的混合液全部吸入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃离心液。
6、于滤柱中加入700μL Wash Buffer RW1液，12000rpm，离心15s。
7、从QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支干净的2mL收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，12000rpm，离心15s。
8、弃收集管中的离心液，再于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，13000~14000rpm，离心2min。
9、将滤柱移到一个干净的1.5mL eppendorf管上，向滤柱中加入30~50μL的Rnase-free Water，室温静置1~3min。
10、12000rpm，离心1min，收集离心液即为提取的病毒RNA，立即做实验或-20℃以下保存。
注意：Buffer RPE使用之间加44mL无水乙醇。
（二）反应体系配制
1、实验设计：
检测标本RNA
质控参数：
阴性对照：无菌水（标本RNA提取时，跟标本同时提取无菌水。）
阳性对照：已知病毒RNA
2、PCR反应体系配制（在体系配制区配反应液）
1）按下表加入试剂：
PCR反应体系组 分体 积（μL）RNase Free Water
5×RT-PCR Buffer11.9×n
5×n10mM dNTP Mixture1×nEnzyme Mix1×nRNase Inhibitor0.1×n上游引物0.5×n下游引物0.5×nTotal20×n对每一个建立的反应确定反应数（n=拟进行的PCR管数，包括阴性，阳性对）。考虑到阴性无模板对照，阳性对照，误差，制备过量的反应混合物是必要的。具体如下：
（1）如果包括对照，样品的数量（n）为1到14，那么N=n+1；
（2）如果包括对照，样品的数量（n）大于15，那么N=n+2。
2）将上述反应液混匀，分装到0.2mL PCR小管中，每管20μL，分别做好标记。
3）加RNA模板（在核酸提取区）
将上述分装好的PCR小管分别加入模板。首先加入阴性对照管（5μL无菌水），然后分别加标本RNA（每管5μL），最后加入阳性对照RNA（每管5μL）。
3、RT-PCR反应
将上述加好模板的反应管混匀，短暂离心后放入PCR仪进行RT-PCR
扩增，反应程序如下：温度 (C)时间循环数60℃1min142℃10min50℃30min95℃15min94℃30s3552℃30s72℃1min72℃7min14℃保存4、RT-PCR产物检测
1）2.0%琼脂糖凝胶制备：称取2.0g Agarose，倒入耐热玻璃瓶内，再加入电泳液（1×TBE）100mL，轻轻混匀后加热，使Agarose完全熔化。待Agarose胶温度降至50～60℃左右，加入核酸染料，轻轻混匀（不要产生气泡）。待胶温度降至50℃左右时，将其倒入制胶板，插好电泳梳子。待胶完全凝固（约30～60min）之后，将梳子拔出。
2）将制备好的电泳胶放入电泳槽（带梳子孔的一端在阴极），倒入电泳液（1×TBE）浸过胶面即可。
3）PCR产物各取10μL，加入2μL上样缓冲液（6×Loading Buffer），混匀后加入电泳胶孔内（先加Marker（DL－2000）5μL，然后依次加标本PCR产物，再加阴性对照，最后加阳性对照产物）。
4）电泳电压100V，约30～40min后看结果。
5）将电泳胶放入凝胶成像系统观察结果并照相。
5、结果判断
在系统成立，即阴阳性参考均正常的条件下，各引物所代表意义如下：PCR引物待检样品1待检样品2待检样品3待检样品4待检样品5待检样品6FluA_+++++/-H1HA__++++/-HuH1HA__+__+/-SWH1HA-1___+_+/-RnaseP+++++_结果判断非甲型流感病毒甲型流感病毒
非H1N1亚型人季节性H1N1亚型流感病毒猪H1N1亚型流感病毒
送国家流感中心复核送国家流感中心检测标本不是人源标本/标本中细胞量少/实验或仪器问题